Rôle des cyclophilines dans la réplication des Coronavirus

Role of cyclophilines in the replicative cycle of Coronavirus

• Auteur / Autrice : Manon Delaplace
• Direction : Sophie Le Poder
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biologie moléculaire et cellulaire
• Date : Soutenance le 17/12/2021
• Etablissement(s) : Paris, AgroParisTech
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Agriculture, alimentation, biologie, environnement, santé (Paris ; 2015-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Virologie (Maisons-Alfort, Val-de-Marne) - AgroParisTech (France ; 2007-....)
• Jury : Président / Présidente : Pierre-Emmanuel Ceccaldi
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Raphaël Gaudin, Jean Dubuisson, Abdelhakim Ahmed-Belkacem
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Raphaël Gaudin, Jean Dubuisson

Mots clés

Mots clés contrôlés

Péritonite

Maladies

Chat domestique

Virus

Antiviraux

Covid-19

Mots clés libres

Cyclophilines

Coronavirus

Antiviraux

Cycle de réplication

Cyclophilin

Coronavirus

Antivirals

Replicative cycle

Résumé

Les Coronavirus (CoVs) forment une famille regroupant de nombreux virus qui peuvent infecter l’Homme et les animaux. Il n'existe actuellement aucun traitement spécifique des infections à coronavirus. Chez le chat, un des coronavirus félins, le virus de la péritonite infectieuse féline (FIPV) provoque une pathologie systématiquement létale. De par leur plasticité génomique et leur capacité à infecter de multiples espèces animales, mammifères ou oiseaux, les CoVs représentent une menace d’émergence continue. Les dernières émergences chez l'Homme du SARS-CoV, du MERS-CoV et plus récemment de SARS-CoV-2 sont le fruit de transmissions interspécifiques entre la faune sauvage et l'Homme. Des études récentes ont montré que les cyclophilines (CyP), des protéines cellulaires très conservées, sont indispensables au cycle réplicatif des CoVs mais les modes d’actions précis de ces protéines ne sont pas connus. Pour étudier le rôle des cyclophilines dans la réplication des coronavirus, nous avons utilisé de petites molécules inhibitrices des cyclophilines (SM-CypI) développées récemment, qui sont nonimmunosuppressives. Nous avons criblé 21 SM-CypI ainsi que la Cyclosporine A (CsA) comme inhibiteur de référence. Neuf SM-CypI avaient une activité inhibitrice de la réplication du FIPV supérieure à celle de la CsA. Sur les neuf molécules, trois ont été sélectionnées : la molécule nommée 83233, se révélant être le meilleur inhibiteur du virus FIPV, et les molécules 832 et 833 qui sont apparentées au 83233. Des expériences de temps d’addition où les molécules antivirales étaient appliquées à différents temps postinfection (1h, 3h, 6h, 9h et 12h) ou avant l’infection, ont montré que l’effet antiviral de ces molécules était maximal lorsqu’elles étaient appliquées au moment de l’infection ou 1h après. Dans toutes les autres conditions expérimentales, leur effet antiviral décroit. Nous avons ainsi déterminé que les cyclophilines étaient essentielles à une étape précoce de la réplication du coronavirus félin. Cette ou ces étapes correspondrai(ent) à la décapsidation et/ou la mise en place du complexe de réplication virale. Pour compléter notre étude sur les mécanismes d’action des cyclophilines, nous avons entrepris de déterminer quelles seraient les protéines virales pouvant interagir avec les cyclophilines cellulaires, en particulier la cyclophiline A. Ainsi, par la technique de ligation de proximité (Proximity Ligation Assay (PLA) en anglais), nous avons pu identifier que la protéine N du coronavirus félin interagissait avec la cyclophiline A féline. Cette interaction n’avait jusqu’à présent été montrée que sur des modèles de coronavirus et cyclophilines humaines, suggérant que les mécanismes d’interaction des cyclophilines avec les protéines des coronavirus pourraient être conservés. Pourtant, lors de tests d’inhibition effectués avec les SM-CypI sur le virus de la bronchite infectieuse aviaire, un gammacoronavirus, l’effet inhibiteur des molécules était modéré. Ces travaux ont permis d’apporter de nouvelles connaissances sur le rôle des cyclophilines dans la réplication des coronavirus et suggèrent que ce rôle pourrait être conservé au moins au sein des coronavirus infectant les mammifères. Nos données ont également permis d’identifier une cible thérapeutique intéressante, ainsi que des molécules présentant un effet antiviral majeur contre certains coronavirus, permettant d’envisager de nouvelles stratégies thérapeutiques.

Coronaviruses (CoVs) are viruses leading to fatal diseases in humans and animals for which there is no specific treatment. In cats, one of the feline coronaviruses, the feline infectious peritonitis virus (FIPV) causes a systematically lethal pathology in cats. Because of their genomic plasticity and their ability to infect multiple animal species, mammals or birds, CoVs represent a constant risk of emergence. The latest human emergences of SARS-CoV, MERS-CoV and more recently SARS-CoV-2 are the result of interspecific transmissions between wildlife and humans. Recent studies have shown that cyclophilins (CyP), which are highly conserved cellular proteins, are required for the replicative cycle of CoVs but the specific modes of action of these proteins are undetermined.To investigate the role of cyclophilins in coronavirus replication, we used newly developed small molecule cyclophilin inhibitors (SM-CypI), which are non-immunosuppressive. We screened 21 SM-CypIs as well as Cyclosporin A (CsA) as a reference inhibitor. Nine SM-CypIs had a greater FIPV replication inhibitory activity than CsA. Of the nine molecules, three were selected: the molecule named 83233, which was shown to be the best FIPV inhibitor and the molecules 832 and 833 from which 83233 was developed. Using these cyclophilin inhibitors and performing experiments where these antiviral compounds were applied at different times post-infection (1h, 3h, 6h, 9h and 12h) or before infection, we showed that the antiviral effect of these compounds was maximal when they were administered at the time of infection or 1h after. In all other experimental conditions, their antiviral effect was reduced. We thus determined that cyclophilins were essential at an early step of feline coronavirus replication. This step(s) would correspond to the decapsidation and/or the establishment of the viral replication complex.To complement our study on the mechanisms of action of cyclophilins, we aimed to determine which viral proteins could interact with cellular cyclophilins, especially cyclophilin A. We identified that the N protein of the feline coronavirus interacts with feline cyclophilin A using a Proximity Ligation Assay (PLA). This interaction had so far only been shown in human models of coronavirus and cyclophilins. Thus, the mechanisms of interaction of cyclophilins with coronavirus proteins might be conserved. However, during inhibition tests with SM-CypI against the avian infectious bronchitis virus, a gammacoronavirus, the inhibitory effect of the molecules was moderate.This work has provided new insights into the role of cyclophilins in coronavirus replication and suggests that this role may be conserved at least in mammalian coronaviruses. Our data also enabled us to identify an interesting therapeutic target, as well as molecules presenting a major antiviral effect against various coronaviruses, which could lead to new therapeutic strategies.