Étude de la sélectivité d'acylation enzymatique de peptides : prédiction de la sélectivité de la lipase B de Candida antarctica par modélisation moléculaire et recherche de nouvelles enzymes spécifiques de type aminoacylases
Auteur / Autrice : | Florent Ferrari |
Direction : | Isabelle Chevalot, Catherine Humeau-Virot |
Type : | Thèse de doctorat |
Discipline(s) : | Génie des procédés et des produits |
Date : | Soutenance le 10/10/2014 |
Etablissement(s) : | Université de Lorraine |
Ecole(s) doctorale(s) : | RP2E - Ecole Doctorale Sciences et Ingénierie des Ressources, Procédés, Produits, Environnement |
Partenaire(s) de recherche : | Laboratoire : Laboratoire réactions et génie des procédés |
Jury : | Président / Présidente : Jean-Luc Blin |
Examinateurs / Examinatrices : Éric Husson, Stéphane Delaunay | |
Rapporteurs / Rapporteuses : Eric Dubreucq, Marianne Graber |
Résumé
Les peptides sont des molécules pouvant posséder une activité biologique intéressante (antibiotique, anti-oxydante, antivirale, anti-hypertensive…). Ce sont cependant des molécules difficiles à utiliser car elles possèdent un faible temps de demi-vie in vivo et sont peu bio-disponibles. Le greffage d’un acide gras permet de les protéger et d’accroître leur potentiel d’action. Cette réaction appelée acylation peut être catalysée par des enzymes. A l’heure actuelle, peu de recherches sont faites sur l’acylation de peptides par voie enzymatique et sur la recherche de nouveaux biocatalyseurs adaptés pour cette réaction. Les objectifs de cette thèse ont été, dans un premier temps, de comprendre les mécanismes de la sélectivité d’acylation de peptides de la lipase B de Candida antarctica par une approche de modélisation moléculaire combinant docking et dynamique moléculaire, couplée à une approche expérimentale. Cette étude a permis d’identifier des interactions enzyme-substrats impliquées dans la sélectivité enzymatique et a permis de construire un modèle expliquant la régio- et chimio-sélectivité de l’acylation peptidique catalysée par cette enzyme. Dans un deuxième temps, une étude préliminaire a été menée afin d’identifier de nouvelles enzymes de type acylases présentes dans des surnageants de culture de différentes espèces de Streptomyces. Ces enzymes sont capables de catalyser des réactions d’acylation de peptides en milieux aqueux. Une méthode de semi-purification a été établie et une étude comparative a été menée sur la sélectivité d’acylation de la lipase B de C. antarctica et celle de nouvelles enzymes de type aminoacylases présentes dans un extrait protéique de surnageant de culture de Streptomyces ambofaciens. Ces nouvelles enzymes présentent une spécificité différente de celle de la lipase B de C. antarctica, permettant notamment, une acylation des acides aminés sur leur fonction amine en position α. Une caractérisation partielle des activités amino-acylase du surnageant de culture de S. ambofaciens a été réalisée. Dans une troisième et dernière partie, une comparaison des séquences génétiques a été réalisée entre treptomyces mobaraensis et S. ambofaciens afin d’identifier les gènes codant pour les acylases découvertes chez S. ambofaciens. Des mutants de S. ambofaciens délétés pour ces gènes ont été construits et la fonctionnalité des enzymes codées par ces gènes a été vérifiée ; enfin, une expression hétérologue de l’ε-lysine acylase a été initiée