Etude in vitro des interactions entre la protéine NS1 du virus respiratoire syncytial et la sous-unité MED25 du Médiateur humain

In vitro study of the interactions between the NS1 protein of the respiratory syncytial virus and the MED25 subunit of the human Mediator

• Auteur / Autrice : Jiawei Dong
• Direction : Christina Sizun
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biologie structurale
• Date : Soutenance le 11/12/2024
• Etablissement(s) : université Paris-Saclay
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Innovation thérapeutique : du fondamental à l'appliqué (Châtenay-Malabry, Hauts-de-Seine ; 2015-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Institut de chimie des substances naturelles (Gif-sur-Yvette, Essonne ; 1959-....)
• Partenaire(s) de recherche : Référent : Université Paris-Saclay. Faculté de pharmacie (Orsay, Essonne ; 2020-....)
• Partenaire(s) de recherche : graduate school : Université Paris-Saclay. Graduate School Life Sciences and Health (2020-….)
• Jury : Président / Présidente : Sonia Longhi
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Isabelle Landrieu, Cameron Mackereth, Iñaki Guijarro, Ludovic Carlier
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Isabelle Landrieu, Cameron Mackereth
• DOI : 10.70675/06e502b1zec5cz4489z967az642990979317

Mots clés

Mots clés contrôlés

Virus respiratoire syncytial humain

Interactions hôte-agent pathogène

Protéines virales

Résonance magnétique nucléaire

Complexe médiateur

Mots clés libres

Protéine non structurale NS1

Virus Respiratoire Syncytial

Med25

Interactions hôte-Pathogène

Complexes protéiques

Résonance Magnétique Nucléaire

Non structural protein NS1

Respiratory Syncytial Virus

Med25

Host-Pathogen interactions

Protein complexes

Nuclear Magnetic Resonance

Résumé

Le virus respiratoire syncytial (VRS) est une cause majeure d'infections respiratoires sévères, notamment chez les nourrissons et les jeunes enfants. Il parvient à échapper au système immunitaire inné notamment grâce à ses deux protéines non structurales NS1 et NS2. La protéine NS1 joue le rôle d'antagoniste des interférons. Elle inhibe la production d'interférons ainsi que leurs voies de signalisation. Cependant, une nouvelle hypothèse suggère qu'elle pourrait également contribuer à réguler l'expression des gènes de l'hôte via une interaction avec la sous-unité MED25 du complexe médiateur, un coactivateur de la transcription par l'ARN polymérase II. Mon travail de thèse porte sur la caractérisation structurale de cette interaction in vitro.Dans un premier temps, j'ai voulu m'assurer que la protéine NS1 était sous forme native dans les conditions où sont faites les expériences d'interaction. En effet, NS1 peut être produite sous forme de protéine recombinante dans E. coli et une structure cristallographique de NS1 est disponible : elle révèle un domaine globulaire ''NS1core'' et une hélice C-terminale ''NS1α3'' située à l'interface d'un dimère. Mais NS1 est difficile à étudier en solution en raison de sa propension à s'auto-associer. J'ai donc analysé le comportement de NS1 dans différentes conditions expérimentales et avec différentes techniques biophysiques : fluorimétrie différentielle à balayage pour la stabilité thermique, dichroïsme circulaire pour la structure secondaire, diffusion de la lumière pour la taille. Cela a permis de mettre en évidence un équilibre entre monomère et dimère de NS1. Un mutant de délétion de NS1, NS1∆α3 qui correspond à NS1core, a pu être étudié à l'échelle du résidu par résonance magnétique nucléaire (RMN). J'ai attribué les fréquences de résonance du squelette peptidique ce qui m'a permis de montrer qu'il était structuré en solution. Les largeurs de raie importantes et les mesures de relaxation 15N pointent vers des phénomènes d'échange. L'attribution de NS1∆α3 m'a permis ensuite d'attribution partiellement la protéine NS1 entière et d'analyser des expériences d'interaction par RMN.La seconde partie de ma thèse s'intéresse à l'interaction entre NS1 et le domaine ACID de MED25. Des études par RMN de la protéine MED25-ACID marquée aux isotopes 15N et 13C avec un peptide correspondant à NS1α3 ont d'abord révélé que NS1α3 interagit avec MED25-ACID. Des expériences de calorimétrie ont montré que la protéine NS1 entière avait une affinité bien supérieure à celle de NS1α3, suggérant une interaction potentielle via le domaine globulaire NS1core en plus de l'hélice NS1α3. Des données obtenues par interférométrie de bio-couches (BLI) ont ensuite confirmé cette interaction. Elles montrent que NS1∆α3 se lie à MED25-ACID avec une affinité plus faible que NS1, en présentant deux modes de fixation. Des modélisations par AlphaFold2 n'ont pas produit de modèle de complexe fiable avec NS1∆α3 ou NS1α3. Mais elles ont permis de prédire avec une certaine fiabilité la structure du complexe MED25-ACID−NS1. Des mutants de NS1, basés sur cette prédiction, ont été testés par BLI, montrant une réduction de l'interaction avec MED25-ACID.

Respiratory syncytial virus (RSV) is a major cause of severe respiratory infections, particularly in infants and young children. It evades the innate immune system notably thanks to its two non-structural proteins, NS1 and NS2. The NS1 protein functions as an interferon antagonist, inhibiting both the production of interferons and their signaling pathways. However, a new hypothesis suggests that NS1 could also contribute to the regulation of host gene expression via an interaction with the MED25 subunit of the mediator complex, a coactivator of transcription by RNA polymerase II. My thesis focuses on the structural characterization of this interaction in vitro.In a first step, I wanted to ensure that NS1 was in its native form under the conditions used for interaction experiments. NS1 can indeed be produced as a recombinant protein in E. coli, and a crystallographic structure of NS1 is available: it reveals a globular domain ''NS1core'' and a C-terminal helix ''NS1α3'' located at the interface of an NS1 dimer. However, NS1 is challenging to study in solution due to its propensity to self-assemble. I thus analyzed the behavior of NS1 under different experimental conditions and by different biophysical techniques: differential scanning fluorimetry to assess stability, circular dichroism to assess secondary structure, and light scattering to assess size. This allowed providing evidence for an NS1 monomer-dimer equilibrium. A deletion mutant of NS1, NS1∆α3 corresponding to NS1core, was amenable to nuclear magnetic resonance (NMR) for structural analysis at the single residue scale. I performed backbone assignment, and showed that it was well folded in solution. Large line-widths and 15N relaxation measurements pointed at exchange phenomena. Assignment of NS1∆α3 then permitted to partially assign full-length NS1 and to analyze NMR interaction experiments.The second part of my thesis focuses on the interaction between NS1 and the ACID domain of MED25. NMR studies using 15N- and 13C-labeled MED25-ACID protein and a peptide corresponding to NS1α3 first revealed that NS1α3 interacts with MED25-ACID. Additionally, calorimetry experiments showed that full-length NS1 had a much higher affinity than NS1α3, suggesting a potential interaction via the globular NS1core domain in addition to the NS1α3 helix. Data obtained from biolayer interferometry (BLI) then confirmed this interaction. These data showed that NS1∆α3 binds to MED25-ACID with lower affinity than NS1, exhibiting two binding modes. AlphaFold2 modeling did not produce reliable complex models with NS1∆α3 or NS1α3. But it allowed reasonably accurate prediction of the structure of the MED25-ACID−NS1 complex. NS1 mutants based on this prediction were tested by BLI, showing a reduction in interaction with MED25-ACID.