Mécanismes de résistance aux peptides antimicrobiens chez Bacillus thuringiensis : rôle de dltX dans la D-alanylation des acides téichoïques

Characterization of the molecular mechanisms involved in Bacillus Cereus resistance to the host immune response : involvement of DltX in the D-alanylation process of B. thuringiensis

• Auteur / Autrice : Rita Kamar
• Direction : Vincent Sanchis, Mireille Kallassy-Awad
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Génétique microbienne
• Date : Soutenance le 26/05/2014
• Etablissement(s) : Paris, AgroParisTech en cotutelle avec Université Saint-Joseph (Beyrouth). Faculté des Sciences
• Ecole(s) doctorale(s) : Ecole doctorale Agriculture, Alimentation, Biologie, Environnement, Santé (Paris ; 2000-2015)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Microbiologie de l'Alimentation au Service de la Santé humaine (Jouy-en-Josas)
• Jury : Président / Présidente : Jean-Marc Reichhart
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Tarek Msadek, Ziad Daoud, Delphine Destoumieux-Garzón, Laure El Chamy
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Tarek Msadek, Ziad Daoud
• DOI : 10.70675/fb3feb2bz808az4b3az8739zb93ce169a470

Mots clés

Mots clés contrôlés

Bacillus cereus

Pathogénicité

Virulence (microbiologie)

Évaluation

Bacillus thuringiensis

Applications scientifiques

Insectes

Essais

Mots clés libres

Résistance

Peptides Anti-Microbiens

Opéron dlt

DltX

Virulence

Immunité innée

Resistance

Antimicrobial peptides

Dlt Operon

DltX

Virulence

Innate immunity

Résumé

Le groupe Bacillus cereus est très hétérogène du point de vue toxicité et il est difficile de prédire le potentiel pathogène d'une souche. Dans ce travail, nous avons étudié les différents phénotypes de colonisation/adaptation à l'hôte, et analysé la corrélation entre ces phénotypes et les maladies humaines, pour une collection de souches représentatives de la diversité pathologique de B. cereus chez l'homme. L'analyse statistique a révélé des corrélations entre plusieurs phénotypes, et une analyse en composante principale a permis de regrouper les souches en deux sous-populations distinctes. Notre étude a ainsi permis de montrer qu'un ensemble de caractères phénotypiques liés au pouvoir pathogène permet de discriminer les souches présentant un historique en maladies infectieuses des souches sans historique. Nous pensons que ces résultats faciliteront l'identification d'un phénotype ou d’une combinaison de phénotypes qui pourraient être utilisés dans le développement de stratégies de prévention des infections par B. cereus. Le résultat de cette étude suggère que B. cereus n'est pas exclusivement un pathogène opportuniste et pourrait plutôt être considéré comme un véritable agent pathogène en soi.Cependant, la virulence est un phénomène multifactoriel impliquant de nombreux facteurs du côté de l'hôte ainsi que de celui de l'agent pathogène envahisseur. Les peptides antimicrobiens (PAMs) cationiques constituent les principales molécules effectrices de l’immunité innée. La résistance des microorganismes vis à vis de ces composés est donc nécessaire pour qu’ils puissent se développer dans l’hôte et exercer leur pouvoir pathogène. Par conséquent, de nombreuses bactéries pathogènes ont développé des stratégies de résistance impliquant la réduction des charges négatives de l’enveloppe bactérienne, réduisant ainsi l'interaction et la fixation de ces PAMs. L'incorporation de résidus D-alanine aux acides téichoïques (ATs) représente l'un des mécanismes les plus courants de résistance bactérienne qui dépendent de telles modifications. Ce processus de D-alanylation est accompli par les produits des gènes de l’opéron dlt. Celui-ci contient cinq gènes dltXABCD dont les séquences sont très conservées dans la quasi-totalité des bactéries à Gram-positif. La première ORF, dltX, code pour une protéine dont la fonction est inconnue. Le but de la seconde partie de ce travail était donc de déterminer si cette protéine est impliquée dans le processus de D-alanylation chez Bacillus thuringiensis. Pour cela, nous avons procédé à une délétion en phase du gène dltX, qui n’affecte pas l’expression des autres gènes de l'opéron. Les caractéristiques de croissance du mutant dltX et celles de la souche de type sauvage se sont avérées similaires in vitro. Cependant la délétion de dltX affecte considérablement la résistance de B. thuringiensis aux PAMs et atténue significativement sa virulence chez deux espèces d’insectes: Galleria mellonella et Drosophila melanogaster. En outre, une analyse HPLC montre que la paroie du mutant dltX est dépourvue de D-alanine, et la mesure de la mobilité électrophorétique indique que cette absence de D-alanylation est associée à un changement de la charge globale à la surface bactérienne. Des expériences de microscopie électronique à balayage montrent aussi des modifications morphologiques du mutant dltX, ce qui suggère que l'absence de D-alanine affecte également la structure de la paroi cellulaire. Nos résultats montrent que DltX est essentiel pour l'incorporation de la D-alanine aux acides téichoïques. Par ailleurs nous avons également démontré que dltX n’affecte pas l’expression de l’opéron dlt. Par conséquent nos résultats indiquent clairement que DltX joue un rôle direct dans la résistance aux PAMs, contribuant ainsi à la survie et la virulence de B. thuringiensis chez les insectes. Ce travail est le premier qui étudie la participation de dltX dans la D-alanylation des ATs.

The Bacillus cereus pathogenic spectrum ranges from strains used as probiotics to human-lethal strains (causing gastrointestinal disorders or local and severe systemic infections). However, prediction of the pathogenic potential of a strain remains difficult. In this work, we studied different phenotypes of colonization/adaptation to the host (adhesion, cytotoxicity, motility, biofilm formation, resistance to antimicrobial peptides and virulence), analyzing the correlation between these phenotypes and human disease in a collection of strains representative of the pathological diversity of B. cereus in humans. Statistical analysis revealed correlations between several phenotypes, and principal component analysis grouped the strains into two distinct subpopulations. We found that strains differed in pathogenic potential and that virulent strains could be differentiated from non-pathogenic strains. We believe that these findings will facilitate the identification of a phenotype or a combination of phenotypes of potential use in the development of effective prevention strategies and/or diagnostic tools for distinguishing between pathogenic and non-pathogenic B. cereus strains. Our result suggests that B. cereus is not an exclusively opportunistic pathogen and could instead be considered a real pathogen per se. However, virulence is a multifactorial phenomenon involving numerous factors from both the host and the invading pathogen. As cationic antimicrobial peptides (CAMPs) are the primary defense mechanism against invading organisms, virulence of pathogens like B. cereus requires bacterial resistance to such compounds. Consequently, many pathogens have developed resistance strategies involving the reduction of the cell envelope negative charge, thereby influencing the binding and interaction of these CAMPs. The incorporation of Dalanine esters into teichoic acids (TAs) represents one of the most common bacterial resistance mechanisms that depend on such charge modifications. That D-alanylation process is accomplished by the gene products of an operon containing five genes, dltXABCD, that is highly conserved among nearly all gram-positive bacteria. The small first ORF, dltX, encodes a protein of unknown function. The aim of the other part of this work was then to establish whether this protein is involved in the D-alanylation process in Bacillus thuringiensis. We therefore constructed an in frame deletion mutant of dltX, without affecting the expression of the other genes of the operon. The growth characteristics of the dltX mutant and those of the wild type strain were similar under standard in vitro conditions. However disruption of dltX drastically impaired the resistance of B. thuringiensis to CAMPs and significantly attenuated its virulence in two insect species: Galleria mellonella and Drosophila melanogaster. Moreover, HPLC studies showed the dltX mutant was devoid of D-alanine, and electrophoretic mobility measurements indicated that the cells carried a higher negative surface charge. Scanning electron microscopy experiments showed morphological alterations of these mutant bacteria, suggesting that depletion of D-alanine from TAs affects cell wall structure. Our findings suggest that DltX is essential for the incorporation of D-alanyl esters into teichoic acids. Moreover, we found that DltX does not affect the expression of the operon. We therefore conclude that dltX is translated into a functional protein that plays a direct biosynthetic, transport or addresser role. Altogether, our results clearly indicate that DltX plays a direct role in the resistance to CAMPs, thus contributing to the survival and virulence of B. thuringiensis in insects. The exact function of that protein remains to be elucidated. This work is the first report examining the involvement of dltX in the Dalanylation of TAs.