Ingénierie de la voie des pentoses phosphate chez la levure Saccharomyces cerevisiae : applications en œnologie

Engineering the pentose phosphate pathway in Saccharomyces cerevisiae : applications for wine making

• Auteur / Autrice : Axelle Cadière
• Direction : Sylvie Dequin
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biotechnologie, microbiologie
• Date : Soutenance le 29/04/2010
• Etablissement(s) : Montpellier, SupAgro
• Ecole(s) doctorale(s) : Sciences des Procédés – Sciences des Aliments (Montpellier ; École Doctorale ; 2009-2014)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : SPO - Sciences Pour l'Oenologie
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Sylvie Dequin, Delphine Sicard, Bruno Blondin
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Juana maria Gancedo, Jean marc Daran

Mots clés

Mots clés contrôlés

Vinification

Saccharomyces cerevisiae

Mots clés libres

Oenologie

Sccharomyces cerevisae

Pentos phosphate

Production d'arômes

Gluconate

Acetate

Résumé

Il existe un intérêt croissant pour le développement de levures S. cerevisiae œnologiques à rendement abaissé de conversion des sucres en alcool. Nous proposons ici une approche originale basée sur la réorientation du flux carboné vers la voie des pentoses phosphate (VPP). Dans un premier temps, nous avons montré que le flux à travers la VPP est limité par le niveau de réoxydation du NADPH et par la capacité de la voie elle même. Nous avons ensuite mis en évidence le rôle crucial du facteur de transcription Stb5 dans le maintien d'un flux basal à travers la VPP. La surexpression de STB5, couplée à l'introduction d'un système de réoxydation du NADPH, est une stratégie intéressante pour amplifier le flux à travers la VPP. En parallèle, une stratégie d'évolution dirigée basée sur l'adaptation des souches sur gluconate, un hexose mal assimilé et incorporé au niveau de la VPP, a été développée. Des souches évoluées présentant une meilleure assimilation du gluconate ont été obtenues après 70, 180 et 240 générations. En fermentation, ces souches produisent la même quantité d'éthanol que la souche parentale mais présentent des phénotypes complètement nouveaux, en particulier des performances fermentaires accrues, de faibles besoins en azote, une production d'acétate réduite et une forte production de composés aromatiques. L'analyse 13C-flux et transcriptomique d'une souche évoluée ECA5 révèle une amplification de la VPP d'un facteur 1.5 par rapport à la souche parentale EC1118, en lien avec la surexpression de GND1 et TKL1. L'expression de nombreux gènes du métabolisme azoté et de la voie Ehrlich, de l'homéostasie des protons et de la glycolyse est augmentée chez ECA5, alors que les gènes de stress et de la respiration sont globalement réprimés, de façon cohérente avec les phénotypes observés. Outre le développement de nouvelles souches d'intérêt œnologique, ce travail apporte un éclairage nouveau sur le fonctionnement de la VPP et sur ses liens avec le métabolisme central et secondaire

There is an ever-growing interest in the development of S. cerevisiae wine yeast strains with reduced ethanol yield. We proposed a novel approach based on rerouting the carbon flux towards the pentose phosphate (PP) pathway. First, we showed that the flux through the PP pathway is limited both by the absence of a mechanism for reoxidation of NADPH and by the intrinsic capacity of the pathway. We also showed that the transcription factor Stb5 plays a key role in maintaining a basal flux through the PP pathway to meet the requirements for NADPH and biosynthetic precursors. Over-expression of STB5 is a potentially useful strategy for increasing the flux through the PP pathway, provided that an alternative system of reoxidation of NADPH is expressed. In parallel, we investigated an evolutionary engineering strategy based on long-term batch culture on gluconate, a substrate poorly assimilated by S. cerevisiae cells and metabolized by the PP pathway. We selected strains that had evolved a greater gluconate consumption capacity after 70, 180 and 240 generations. During wine fermentation, these evolved strains produced similar amounts of ethanol as the parental strain but displayed completely novel phenotypes, including higher fermentation rates, lower nitrogen requirements, lower levels of acetate production, and enhanced production of aroma compounds. 13C flux analysis and transcripomic analysis of one of these strains, ECA5, showed a greater flux through the PP pathway consistent with the observed increased expression of GND1 and TKL1. The expression of genes associated with nitrogen metabolism, the Ehrlich pathway, proton homeostasis and glycolysis was stronger than in the parental strain, whereas genes involved in stress response and respiration were down-regulated, in agreement with the phenotypes of ECA5. In addition to providing strains with considerable potential for wine making, this work sheds new light on the operation of PP pathway and its links with central and secondary metabolism