Ingénierie métabolique et analyse 13C-flux du métabolisme central des levures Saccharomyces cerevisiae œnologiques

par Stéphanie Heux

Thèse de doctorat en Sciences de la santé

Sous la direction de Sylvie Dequin et de Rémy Cachon.

Soutenue en 2006

à Dijon .

mots clés

• Fermentation
• Vinification
• Génie génétique
• Saccharomyces cerevisiae

Résumé

Chez Saccharomyces cerevisiae, dévier le flux carboné vers d’autres sous produits que l’éthanol présente un intérêt à la fois pour l’étude du métabolisme et pour le développement de souches à rendement abaissé en éthanol. Ces souches ont un potentiel en oenologie pour diminuer la teneur en alcool des vins. Une première stratégie a consisté à exprimer une NADH oxydase bactérienne chez S. Cerevisiae, ce qui entraîne une réduction importante de la teneur en NADH et affecte largement la distribution des flux métaboliques. En conditions de microoxygénation contrôlée, le rendement en éthanol est abaissé de 7% mais la formation de métabolites plus oxydés est favorisée. Afin d’éliminer les carbones sous forme de CO2, une deuxième stratégie a consisté à dévier le flux de carbones vers la voie des pentoses phosphates (VPP). L’étude de mutants délétés pour PGI1 codant pour la phosphoglucose isomérase suggère que la souche V5, dérivée d’une souche oenologique, présente une capacité limitée de la VPP. Une analyse comparative du réseau métabolique (13C-flux) des souche V5 et ENY. WA-1A a été réalisée. Des différences majeures dans la distribution des flux intracellulaires ont été observées entre les deux souches. La souche oenologique présente un flux considérablement réduit à travers la VPP et oriente préférentiellement son métabolisme vers la biomasse, le glycérol et l’éthanol, ce qui est cohérent avec l’adaptation de cette souche à l’environnement oenologique. Ces résultats apportent un éclairage nouveau sur le métabolisme de ces souches et sur les facteurs limitant la VPP. Ils ouvrent également de nouvelles perspectives pour l’étude de la diversité métabolique au sein de l’espèce S. Cerevisiae.

Titre traduit

Metabolic engineering and 13C-flux analysis of central metabolism of wine yeast Saccharomyces cerevisiae

Résumé

In Saccharomyces cerevisiae, rerouting the carbon flux towards the formation of by-products other than ethanol promises to both offer insight into yeast metabolism and allow the development of strains with reduced ethanol yield; such strains could be used to decrease the ethanol content of wines. A first approach to do this involved the introduction of a bacterial NADH oxidase into S. Cerevisiae, resulting in a significant decrease in NADH production and a large redistribution of metabolic fluxes. Under controlled microaeration conditions, the ethanol yield declined by 7%, although the synthesis of oxidized metabolites increased. A second strategy, devised to remove a portion of the glucose as CO2, was based on the diversion of the carbon flux towards the pentose phosphate (PP) pathway. The phenotype of a phosphoglucose isomerase pgi1 mutant suggested that the PP pathway in the wine yeastderived strain V5 was limited. A comparative 13C-flux analysis of the metabolic networks of V5 and the ENY. WA-1A laboratory strain was performed. Major differences were observed in the flux distribution between the two strains. In the wine yeast, the flux through the PP pathway was markedly reduced, with fluxes redirected towards the formation of biomass, glycerol, and ethanol, consistent with the physiological fitness of this strain for wine fermentation conditions. These results shed new light on the metabolism of these strains and on the factors that act to limit the PP pathway. They also offer new perspectives for studying the metabolic diversity present in S. Cerevisiae species.