Développement et optimisation de l'efficacité et de la persistance des CART anti GD2 dans le neuroblastome

Development and optimization of anti GD2 CART efficacy and persistence in neuroblastoma

• Auteur / Autrice : Lucille Lew-Derivry
• Direction : Sebastian Amigorena, Isabelle Janoueix- lerosey
• Type : Projet de thèse
• Discipline(s) : Sciences du Vivant
• Date : Inscription en doctorat le 01/11/2024
• Etablissement(s) : Université Paris sciences et lettres
• Ecole(s) doctorale(s) : Sciences du Vivant
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Immunité et Cancer
• Partenaire(s) de recherche : Equipe de recherche : Réponse Immunitaire et Cancer
• Partenaire(s) de recherche : établissement opérateur d'inscription : Institut Curie - PSL

Mots clés

Mots clés libres

Immunotherapie

Biomarqueurs

Tumeurs solides

Cellules CAR-T

Etudes ancillaires

Biomarkers

CAR T cells

Immunotherapy

Ancillary studies

Solid tumors

Résumé

Le neuroblastome (NB) est une tumeur pédiatrique agressive qui dérive des cellules de la crête neurale et qui représente 8-10% des tumeurs pédiatriques. Dans les formes de haut risque cette maladie reste, malgré un traitement multimodal intensif, de très mauvais pronostic avec un taux de survie à 5 ans autour de 50 %. De nouvelles alternatives thérapeutiques sont nécessaires pour améliorer la prise en charge de ces patients. Comme le traitement par cellules CAR-T (cellules T exprimant un Récepteur Antigénique Chimérique) a révolutionné la prise en charge des patients atteints d'hémopathies malignes en rechute ou réfractaires, certaines équipes, comme celle de Franco Locatelli à Rome ont développé un nouveau CAR de 3e génération reconnaissant GD2 en traitement des neuroblastomes de haut risque. GD2 est un disialoganglioside fortement exprimé à la surface des cellules de neuroblastome, bien connu et déjà utilisé comme cible tumorale pour le traitement de cette maladie. Cet essai clinique de phase 1/2 a montré que l'utilisation de CAR-T anti-GD2 de 3e génération chez des patients réfractaires ou en rechute de NB présentait un profil de tolérance acceptable mais avec une efficacité limitée notamment chez les patients avec une charge tumorale élevée (9 réponses complètes et 8 réponses partielles sur 27 patients traités) qui reste à confirmer dans une cohorte de patients plus large. De manière plus globale, contrairement aux hémopathies, le traitement des tumeurs solides par cellules CAR-T reste un défi du fait de certains écueils comme l'hétérogénéité de la cible antigénique dans la tumeur, l'accessibilité limitée à la cible, le micro-environnement tumoral immunosuppresseur qui induit une persistance limitée des cellules CAR-T dans le temps. Plusieurs voies d'optimisation ont été explorées afin de contourner ces problématiques dans des modèles d'hémopathie ou carcinome : - La modification du domaine de signalisation intra-cellulaire du CAR (inactivation de 2 des 3 motifs ITAM dans la chaine CD3z) par l'équipe de Michel Sadelain permet aux cellules CAR-T une meilleure efficacité avec l'acquisition d'un profil effecteur mémoire et donc une meilleure persistance. - Dans la même idée d'optimiser la persistance des cellules CAR-T, les équipes de recherche de l'Institut Curie (équipe de Sebastian Amigorena) ont développé une technologie exclusive visant à modifier les cellules CAR-T basée sur la reprogrammation épigénétique par le knock-out (KO) de l'histone méthyltransférase Suv39h1 permettant de leur conférer un profil mémoire. - L'équipe de Nicolas Manel, à Curie, a montré que la surexpression de la forme non-acétylée K5R de RELA, un régulateur transcriptionnel impliqué dans la voie NFkB, restaurait la production d'IFN-I par les cellules T notamment CD4+. Ainsi, des cellules CAR-T RELA K5R modifiées montreraient une meilleure activité antitumorale par l'augmentation de la réponse IFN-I. Des analyses préliminaires ont déjà été réalisées dans le laboratoire avec une construction de CAR GD2-1XX. Les résultats ont montré que les cellules T transduites exprimaient bien le CAR GD2 et que ces CAR avaient un effet anti-tumoral in vitro sur des lignées GD2+. Objectifs et intérêts L'objectif de cette thèse est de produire et développer des CAR-T cells anti-GD2 optimisées par les 3 axes d'améliorations proposés ci-dessus (1XX, SUV39H1-KO et RELA K5R) et de montrer leur efficacité in vitro et in vivo sur des lignées cellulaires de neuroblastome. L'hypothèse est que les CAR-T GD2 1XX inactivées pour SUV39H1 ou surexprimant RELA K5R, ou la combinaison des deux, auront une meilleure efficacité et une meilleure persistance qu'un CAR-T non modifié de 2ème ou 3e génération, permettant de dépasser les limites thérapeutiques observées dans l'essai GD2-CART. Méthodes La production des cellules CAR-T se fera par activation de cellules T humaines, puis transduction par un lentivirus afin de leur faire exprimer le CAR anti-GD2. Nous utiliserons différents lentivirus avec des constructions différentes : 3e génération 4.1BB/CD28, 2e génération CD28/1XX, et CD28/1XX/RELA K5R. Après transduction, les cellules CAR-T subiront ou non un KO de SUV39H1 par CrispR/Cas9. Nous comparerons le taux de transduction de ces cellules et leur profil phénotypique par FACS. Il est possible que l'accumulation des modifications du CAR conduise à une activation trop importante et un épuisement de ceux-ci par un signal tonique trop important qu'il sera important de mesurer en cytométrie. Nous testerons ensuite la cytotoxicité de ces cellules CAR-T in vitro sur des modèles de lignées de neuroblastome GFP-luciférase+ exprimant ou non GD2. Nous mesurerons le taux de destruction des cellules tumorales en fonction des différents ratio effecteurs/cibles ainsi que le taux de cytokines produites et libérées dans le milieu. Nous comparerons les marqueurs d'activation et d'exhaustion des CAR-T après contact avec leur cible par FACS. Nous pourrons mesurer l'épuisement des différents CAR-T GD2 en restimulant les effecteurs avec leur cible à plusieurs reprises dans le temps. Selon les résultats obtenus in vitro, nous vérifierons l'efficacité in vivo sur des modèles murins NGS préalablement injectés avec des lignées de neuroblastome GFP-luc en suivant le développement tumoral par imagerie in vivo en bioluminescence. Ces modèles in vivo nous permettront d'étudier le microenvironnement tumoral myéloïde avant et après contact avec les CAR-T, la potentielle modification de la cible antigénique GD2 à la surface de la tumeur, les modifications phénotypiques des CAR-T après contact avec leur cible et de comparer la persistance des CAR-T à long terme dans la circulation sanguine et après nouvelle injection de tumeur. Perspectives et débouché scientifique L'objectif final de ce travail est la production de ces CAR-T GD2 optimisés dans le cadre d'un essai clinique de phase 1-2 chez des patients avec des neuroblastomes de haut risque réfractaires ou en rechute.

Neuroblastoma (NB) is an aggressive pediatric tumor originating from neural crest cells, accounting for 8-10% of pediatric cancers. High-risk forms of NB have poor prognoses, with a 5-year survival rate of approximately 50%, despite intensive multimodal treatment. New therapeutic alternatives are urgently needed. CAR-T cell therapy (Chimeric Antigen Receptor T-cells) has revolutionized the treatment of refractory or relapsed hematologic malignancies. Some teams, like Franco Locatelli's in Rome, developed a third-generation GD2-specific CAR-T therapy for high-risk neuroblastoma. GD2 is a tumor-associated disialoganglioside highly expressed on neuroblastoma cells and has already been explored as a therapeutic target. A Phase 1/2 clinical trial demonstrated acceptable safety but limited efficacy, especially in patients with a high tumor burden (9 complete responses and 8 partial responses out of 27 treated patients). Unlike hematologic malignancies, CAR-T therapy for solid tumors faces challenges like antigen heterogeneity, limited antigen accessibility, and immunosuppressive tumor microenvironments that reduce CAR-T cell persistence. Several strategies have been investigated to optimize CAR-T cells for solid tumors, including: - Signaling Domain Modifications: Disabling two of the three ITAM motifs in the CD3ζ chain improves CAR-T cell persistence and memory profile. - Epigenetic Reprogramming: The Suv39h1 knockout (KO) improves CAR-T memory through histone methyltransferase inhibition. - Transcriptional Modifications: Overexpression of RELA K5R enhances antitumor activity via increased interferon (IFN)-I response. Initial experiments with a GD2-1XX CAR showed effective CAR expression and antitumor activity in vitro against GD2+ neuroblastoma lines. The research aims to develop optimized anti-GD2 CAR-T cells using the following strategies: - 1XX signaling domain modification - SUV39H1 knockout - RELA K5R overexpression The hypothesis is that these optimizations will enhance CAR-T efficacy and persistence compared to second or third-generation CAR-T cells. Methods : CAR-T cells will be generated using lentiviral transduction to express various CAR constructs. SUV39H1 will be knocked out using CRISPR/Cas9. The efficacy and persistence of these CAR-T cells will be assessed via: - Phenotypic and functional analysis (e.g., cytotoxicity, cytokine production, activation/exhaustion markers) - In vitro studies on neuroblastoma cell lines. - In vivo studies using mouse models with neuroblastoma, monitored by bioluminescence imaging. The ultimate goal is to produce optimized GD2-specific CAR-T cells for Phase 1/2 clinical trials in patients with refractory or relapsed high-risk neuroblastoma.