Exploration

of novel cold-active transglutaminases for preparing protein-based biomaterials

• Auteur / Autrice : Han Liu
• Direction : Corinne Nardin, Yi Zhang
• Type : Projet de thèse
• Discipline(s) : Chimie analytique
• Date : Inscription en doctorat le 08/02/2022
• Etablissement(s) : Pau
• Ecole(s) doctorale(s) : Sciences Exactes et leurs Applications
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Institut des sciences analytiques et de Physico-chimie pour l'Environnement et les Matériaux

Mots clés

Mots clés libres

Transglutaminase

Activité à basse température

Expression recombinante

Réticulation

Protéine

Biomatériau

Transglutaminase

Cold activity

Recombinant expression

Crosslinking

Protein

Biomaterial

Résumé

La transglutaminase (TGase, EC 2.3.2.13) est une enzyme de réticulation largement reconnue, catalysant la formation de liaisons isopeptidiques covalentes entre les résidus de glutamine et de lysine, ce qui améliore les propriétés structurelles et fonctionnelles des biomatériaux à base de peptides et de protéines. La demande croissante d'utilisations de la TGase dans des procédés à basse température, notamment dans les industries agroalimentaire et biomédicale, stimule l'exploration d'enzymes actives à froid. Par ailleurs, l'activité réduite des TGases commerciales à basse température limite leur utilisation dans des conditions thermosensibles. Cette étude vise donc à découvrir et à exploiter des TGases actives à froid pour le développement de biomatériaux protéiques fonctionnels, adaptés à des procédés de mise en œuvre doux et à basse température. Dans cette thèse, une méthode innovante a d'abord été développée pour préparer des gels souples de β-lactoglobuline (β-LG) par un traitement thermique combiné à une réticulation enzymatique à l'aide d'une transglutaminase microbienne commerciale (mTGase). La méthode consistait à chauffer des solutions diluées de β-LG (5 % (p/v), pH 7,5) à 80 °C pendant 30 min afin de favoriser le dépliement et l'agrégation des protéines, suivi d'une catalyse par la mTGase à 50 U TGase/g β-LG. Les gels obtenus ont été caractérisés par des analyses rhéologiques, FTIR, TGA et TEM. Leur potentiel en tant qu'alternatives aux gels d'agar couramment utilisés a été évalué par un test de perforation, mettant en évidence leurs propriétés texturales uniques, notamment leur souplesse et leur faible fragilité. S'inspirant de cette étude, des applications potentielles des transglutaminases actives à froid ont ensuite été explorées. Une transglutaminase recombinante active à froid (rTGase) a été exprimée avec succès sous forme soluble dans Escherichia coli (E. coli) par induction à basse température (20 °C). Cette rTGase a été utilisée pour réticuler des hydrolysats de protéines de pois (PPH) à 4 °C, modifiant efficacement la distribution des poids moléculaires des peptides. Les PPH réticulés ont présenté une structure plus stable et compacte, comme le montrent les analyses par spectroscopie de fluorescence, absorption UV-Vis et FTIR. La formation de liaisons isopeptidiques covalentes contribue à une hydrophobicité de surface accrue ainsi qu'à une meilleure stabilité thermique. Enfin, un nouveau gène de TGase adaptée au froid (akTGase), codant une protéine de 748 acides aminés (84,76 kDa), a été identifié à partir du transcriptome du plancton antarctique. Ses caractéristiques d'adaptation au froid ont été prédites par l'analyse de la composition en acides aminés, la prédiction de la structure secondaire et des simulations de dynamique moléculaire (MD). Une validation expérimentale de son activité à froid a été réalisée via une surexpression hétérologue dans E. coli, suivie d'un repliement par dialyse progressive et de mesures d'activité enzymatique. Pour conclure, cette thèse propose une évaluation exhaustive et une application approfondie des TGases actives à froid, structurées autour de trois volets principaux: (1) la caractérisation fonctionnelle d'une TGase commerciale dans des biomatériaux à base de protéines, en particulier les gels de β-LG; (2) l'expression soluble d'une TGase active à froid dans E. coli et son application dans la réticulation de protéines d'origine végétale; (3) la découverte et la validation d'une nouvelle TGase adaptée au froid. Les résultats obtenus apportent des connaissances précieuses ainsi que de nouveaux outils enzymatiques pour la modification des protéines à basse température. Ils ouvrent également des perspectives prometteuses pour la conception de biomatériaux protéiques dans les domaines de l'agroalimentaire, de la pharmacie et des biotechnologies.

Transglutaminase (TGase, EC 2.3.2.13) is a widely recognized crosslinking enzyme that catalyzes the formation of covalent isopeptide bonds between glutamine and lysine residues, thereby enhancing the structural and functional properties of peptide- and protein-based biomaterials. The increasing demand for TGase applications at low-temperature processing, such as in the food and biomedical industries, urges the exploration of cold-active TGase. Additionally, the limited activity of commercial TGase at low temperatures restricts its applicability in temperature-sensitive conditions. Thus, the present study focuses on the discovery and application of cold-active TGases for the development of functional protein biomaterials under mild and low-temperature conditions. In this thesis, an innovative method was first developed to prepare soft β-lactoglobulin (β-LG) gels through heat treatment combined with enzymatic crosslinking using commercial microbial TGase (mTGase). The method included heating low-concentration β-LG solutions (5% (w/v), pH 7.5) at 80 °C for 30 min to facilitate protein unfolding and aggregation, followed by TGase catalysis at 50 U TGase/g β-LG. The soft β-LG gels were characterized using rheology, FTIR, TGA, and TEM analyses. Their potential as alternatives to commonly used agar gels was assessed by comparing their textural properties via puncture test, suggesting the unique properties of β-LG gels with favorable softness and lower brittleness. Inspired by this study, potential applications using cold-active TGase were further explored. A recombinant cold-active TGase (rTGase) was successfully expressed in a soluble form in Escherichia coli (E. coli) through induction at low temperature (20 °C). The rTGase was applied to crosslink pea protein hydrolysates (PPH) at 4 °C, effectively shifting the molecular weight distribution of the peptides. The crosslinked PPH showed a more stable and compact structure analyzed by fluorescence spectroscopy, ultraviolet-visible (UV-Vis) absorption and FTIR measurements. The formation of covalent isopeptide bonds contributed to the increased surface hydrophobicity and enhanced thermal stability. Finally, a novel cold-adapted TGase (akTGase) gene encoding 748 amino acid residues of 84.76 kDa was identified from the transcriptome of Antarctic krill. Cold-adaptation characteristics were predicted through amino acid composition analysis, secondary structure prediction, and molecular dynamics (MD) simulations. Experimental validation of cold activity was conducted by heterologous overexpression of akTGase in E. coli, followed by refolding using stepwise dialysis and enzymatic activity measurements. Overall, this thesis presents comprehensive evaluation and application of cold-active TGase, encompassing three aspects: (1) the functional characterization of commercial TGase in protein-based biomaterials, specifically β-LG gels in this thesis, (2) the soluble expression of a cold-active TGase in E. coli and its application in the crosslinking of plant-based proteins, and (3) the discovery and validation of a novel cold-adapted TGase. The findings provide both mechanistic insights and practical enzymatic tools for low-temperature protein modification, and hold great potential for the design of protein-based biomaterials in food, pharmaceutical, and biotechnological applications.