Production et caractérisation de nouvelles amino-acylases par une approche combinée expérimentale/numérique - Mise en œuvre dans des procédés verts de N-acylation

par Laureline Gennesseaux

Projet de thèse en Procédés Biotechnologiques

Sous la direction de Catherine Humeau-Virot et de Yann Guiavarc'h.

Thèses en préparation à l'Université de Lorraine , dans le cadre de SIMPPÉ - SCIENCES ET INGENIERIES DES MOLECULES, DES PRODUITS, DES PROCEDES ET DE L'ÉNERGIE , en partenariat avec LRGP - Laboratoire Réactions et Génie des Procédés (laboratoire) et de Axe 3 - BIOPROMO - Bioprocédés Biomolécules (equipe de recherche) depuis le 12-10-2020 .


  • Résumé

    • Contexte scientifique et industriel Les dérivés acylés de peptides et d'acides aminés constituent des molécules à haut potentiel applicatif en raison de leurs propriétés technofonctionnelles, notamment émulsifiantes et moussantes. Certaines d'entre elles présentent en outre des activités biologiques améliorées par rapport aux composés natifs, en raison d'une meilleure biodisponibilité et d'une plus grande stabilité vis-à-vis de la protéolyse endogène (Hanus et al. 2014). Ces composés biosourcés sont constitués d'un petit peptide ou d'un acide aminé hydrophile et d'une chaîne grasse provenant d'huiles végétales. Ils sont produits actuellement selon la réaction de Schotten Baumann (figure 1), dont les principaux inconvénients sont l'utilisation de chlorures d'acides et de solvants organiques, un manque de sélectivité et la production d'effluents toxiques. De plus, la complexité des milieux de synthèse rend la purification des produits et le traitement des déchets difficiles. Il en résulte un procédé complexe, coûteux, peu compatible avec les exigences de la chimie verte et conduisant à des produits à faible indice de naturalité. Dans ce contexte, le développement de procédés alternatifs plus économiques et respectueux de l'environnement apparaît comme une réelle nécessité. Dans le domaine de la catalyse enzymatique, des études rapportent des résultats très prometteurs obtenus avec les amino-acylases produites par S. mobaraensis catalysant spécifiquement la réaction de N-acylation, en milieu aqueux (Koreishi et al., 2005a, 2005b, 2006, 2007, 2009a, 2009b). Des études récentes menées au LRGP ont montré que les amino-acylases produites par S. ambofaciens sont également très intéressantes pour la réaction de N-acylation. Par ailleurs, certaines d'entre elles présentent des propriétés de sélectivité inédites (Dettori et al., 2018a, Bourkaib et al., 2020). Des procédés catalysés par ces enzymes pourraient constituer une excellente alternative au procédé chimique actuel. Toutefois, les mécanismes et les structures de ces biocatalyseurs demeurent inconnus. Par ailleurs, seuls des mélanges bruts d'enzymes ont été mis en œuvre jusqu'ici, ce qui limite les performances des procédés en terme de sélectivité et rend la phase d'optimisation difficile. • Enjeux et objectifs scientifiques Ce projet vise le développement d'un procédé enzymatique de synthèse de dérivés acylés de peptides et d'acides aminés, sélectif, performant et respectueux des principes de la chimie verte. Des travaux récents réalisés au sein de l'équipe ont permis de démontrer le potentiel des amino-acylases de S. ambofaciens pour catalyser la réaction de N-acylation. Toutefois, leur utilisation à plus grande échelle nécessite d'acquérir des connaissances sur leurs mécanismes d'action et leurs conditions optimales de mise en œuvre. Pour atteindre ces objectifs, une approche combinant expériences et simulations numériques sera mise en place. Des méthodes expérimentales telles que la biologie moléculaire, l'enzymologie, le génie des procédés seront employées en parallèle de simulations de modélisation moléculaire telles que le docking et la construction de modèles d'homologie. L'étude s'organisera autour de 3 axes majeurs d'investigation : - production et purification des 4 amino-acylases recombinantes de S. ambofaciens. Il s'agira d'identifier un système d'expression approprié pour chacune des enzymes et de déterminer les conditions optimales permettant l'obtention de quantités satisfaisantes d'enzyme pure. - étude du potentiel catalytique des amino-acylases de S. ambofaciens. L'activité catalytique de chaque enzyme pure sera caractérisée en termes de sélectivité, spécificité de substrat et performances. Les structures des enzymes les plus prometteuses seront déterminées en combinant les outils classiques d'élucidation structurale (cristallographie, RMN) et la construction de modèles d'homologie. Les modes d'interaction enzyme-substrat seront étudiés grâce à des simulations de docking et des premières hypothèses concernant les éléments responsables des propriétés de sélectivité et de spécificité pourront être formulées (Ferrari et al., 2014 ; Dettori et al., 2018b). - conception et mis en œuvre de procédés enzymatiques de N-acylation. Les conditions opératoires optimales seront déterminées pour chaque enzyme (pH, concentration en substrats, température, …). Différentes configurations de réacteurs et différents modes de conduite du procédé seront envisagés afin d'optimiser les performances des réactions.

  • Titre traduit

    Combined experimental/numerical approach for the production and the characterization of new amino-acylases - Implementation in green N-acylation bioprocesses


  • Résumé

    • Scientific background and industrial context Acylated derivatives of amino acids and peptides are interesting compounds for many industrial applications due to their emulsifying and foaming properties. Furthermore, some of them have improved biological activities when compared with the native biomolecules due to a higher biodisponibility and a higher stability to endogenous proteolysis (Hanus et al. 2014). The structure of these biobased compounds consists of one hydrophilic amino acid or peptide unit and one fatty acid chain from vegetable oils. The industrial scale production process is based on the Schotten Baumann's reaction (figure 1), the main drawbacks of which are the use of acyl chlorides and organic solvents, a lack of selectivity and the production of toxic waste. Moreover, the complexity of the reaction media makes product purification and effluent treatment difficult. All of these factors make the process complex, expensive, unsustainable and strongly impact the naturality index of products. In this context, there is a real need to develop alternative processes, with less environmental and economic impact. Previous studies have shown promising results using amino-acylases from S. mobaraensis that catalyze the N-acylation reaction specifically, in aqueous medium (Koreishi et al., 2005a, 2005b, 2006, 2007, 2009a, 2009b). Recent findings in the laboratory LRGP indicate that amino-acylases from S. ambofaciens are also suitable catalysts for N-acylation reactions. Moreover, some of these enzymes have selectivity properties that have never been described before (Dettori et al., 2018a, Bourkaib et al., 2020). The main brake to their use is the lack of knowledge of their structures and their catalytic mechanisms that remain unknown. Moreover, until now, only crude mixtures of enzymes have been used, which does not allow to take full advantage of their properties and to fully control the processes using them. • Scientific issues and objectives This project aims at developing a selective, efficient and ecofriendly bioprocess for the production of acylated derivatives of amino acids and peptides that could constitute an alternative to the existing chemical production process. As reported in previous studies amino-acylases from S. ambofaciens appeared as promising catalysts for such reactions however their use in efficient and controlled bioprocesses needs to improve our current knowledge about them. To achieve this goal, a combined experimental/numerical approach will be implemented, using experimental tools as molecular biology, enzymology, process engineering and molecular modeling tools as docking and homology models. The study will be organized according to three main issues: - intensifying the production and the purification of the four recombinant amino-acylases from S. ambofaciens. The expression system and the conditions for the production and the purification of each enzyme will be determined aiming to produce sufficient quantities of pure enzymes. - exploring the true potential of each enzyme for the N-acylation of various peptides and amino acids. More precisely, the catalytic activities of the pure enzymes will be addressed basing on their efficiency and their selectivity properties. The structure of the most promising enzymes will be determined basing on structure elucidation data (cristallography, NMR) and homology models. Once structures are elucidated, docking simulations will be performed aiming to study enzyme-substrate binding modes and then, determine the molecular rules for selectivity and substrate specificity (Ferrari et al., 2014 ; Dettori et al., 2018b). Finally, first conclusions about enzyme structure-fonction relationships will be drawn. - designing and implementing enzymatic bioprocesses for selective N-acylation reactions: The optimal conditions will be determined for each enzyme (pH, substrate concentrations, temperature, nature of substrates). Different reactor configurations and process models will be considered in order to optimize the reaction performances.