Thèse en cours

Voies enzymatiques pour la phosphorylation d'alpha-glucanes
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Triangle exclamation pleinLa soutenance a eu lieu le 31/05/2023. Le document qui a justifié du diplôme est en cours de traitement par l'établissement de soutenance.
Auteur / Autrice : Thibaud Laffargue
Direction : Magali RemaudClaire Moulis
Type : Projet de thèse
Discipline(s) : Ingénieries microbienne et enzymatique
Date : Inscription en doctorat le
Soutenance le 31/05/2023
Etablissement(s) : Toulouse, INSA
Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Sciences écologiques, vétérinaires, agronomiques et bioingénieries
Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : TBI - Toulouse Biotechnology Institute, Bio & Chemical Engineering
Equipe de recherche : CIMEs - Catalyse et ingénierie moléculaire enzymatiques
Jury : Président / Présidente : Pedro Coutinho
Examinateurs / Examinatrices : Magali Remaud-simeon, Claire Moulis, Leila Lo leggio, Gianluca Cioci, Christophe Colleoni
Rapporteurs / Rapporteuses : Pedro Coutinho, Leila Lo leggio

Résumé

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Les polysaccharides suscitent un intérêt croissant dans notre société moderne, car ils sont biosourcés et biodégradables. Sous leur forme naturelle, ils présentent souvent des performances moins intéressantes que les polymères synthétiques pétro-sourcés. L'introduction de nouvelles fonctions sur leur squelette permet de diversifier leurs propriétés physico-chimiques, pour leur donner un avantage concurrentiel par rapport aux polymères synthétiques et ouvrir la voie à de nouvelles applications. La phosphorylation est un exemple qui permet d’accroitre la diversité moléculaire. Elle est principalement réalisée chimiquement, ce qui entraine l'utilisation de solvants toxiques, des coûts énergétiques élevés et la dégradation possible des chaînes polysaccharidiques. Pour éviter cela, le recours aux enzymes présente l’avantage de travailler en milieu aqueux et dans des conditions douces. Dans notre étude, nous nous sommes concentrés sur la phosphorylation d'α-glucanes bactériens de structure variées, produits par les α-transglucosylases des familles 13 et 70 des glycoside hydrolases. Nous avons d'abord criblé différentes hexokinases, ainsi que la dikinase de Solanum tuberosum connue pour phosphoryler l'amidon, et être impliquée dans son métabolisme. Après ce premier criblage, la dikinase StGWD1 a été sélectionnée comme outil de travail. Cette enzyme catalyse le transfert du phosphate β de l'ATP sur le C6-OH libre de l'amidon. Sa forme recombinante ainsi que des versions tronquées, conçues à partir de modèles obtenus à l'aide d'AlphaFold2, ont été soumises à des expériences de cristallographie aux rayons X et examinées par SAXS. Cette étude nous as permis de proposer une nouvelle organisation de la protéine en 5 domaines comprenant deux CBM45, un domaine central, un domaine contenant l’histidine catalytique et un domaine de liaison à l'ATP. Nous avons également résolu la première structure 3D du domaine central de l'enzyme, à une résolution de 3,0 Å. Ce domaine adopte un repliement unique et n'a pas d'équivalent dans la PDB. Nos données appuient aussi l’existence d’un mouvement de bascule du domaine histidine catalytique, du domaine central au domaine de fixation de l’ATP, permettant l’autophosphorylation de l’enzyme puis le transfert sur le glucane. De plus, les deux CBM45 ne joueraient pas le même rôle, l’un des CBM étant très éloigné du cœur de l’enzyme. Nous avons également identifié des surfaces de contact entre les domaines, et des acides aminés potentiellement critiques pour ces interactions entre domaines, mais aussi pour la catalyse. En parallèle, nous avons caractérisé l'activité de StGWD1 sur des maltodextrines cristallines et établi des méthodes analytiques pour analyser les différents produits de réaction. Nous avons utilisé des conditions permettant d'obtenir in vitro un degré de substitution proche de celui obtenu in planta. L'enzyme a également été testée pour phosphoryler l'ensemble des α-glucanes bactériens produits à partir du saccharose. Les glucanes principalement composés de liaisons α-1,6, α-1,2 ou α-1,3 ne sont pas substrats de StGWD1, ce qui suggère que la spécificité des CBM pour le glucane à phosphoryler est importante. En revanche, différents glucanes semblables à l'amylose, dont la taille et la cristallinité varient, et qui sont produits par l'amylosaccharase GH13, ont été phosphorylés avec succès à des niveaux comparables à ceux de l'amidon de tubercules de pomme de terre. L'amylopectine et le glycogène allongés par l’amylosaccharase sont également de bons substrats. Ce travail nous a permis de mieux comprendre StGWD1 et d'approfondir la connaissance des relations entre la structure et la fonction de cette enzyme. Il offre également des perspectives intéressantes pour guider des travaux d'ingénierie enzymatique, et rendre l’enzyme plus efficace pour la phosphorylation des polysaccharides dérivés de l'amylosaccharase ou d'autres α-glucanes de structure différente.