Utilisation thérapeutique du sécrétome et des exosomes de cellules souches mésenchymateuses pour la régénération des lésions chondrales chez le Cheval

Therapeutic use of secretome and exosomes from mesenchymal stem cells for the regeneration of chondral lesions in horses

• Auteur / Autrice : Manon Jammes
• Direction : Philippe Galéra, Fabrice Audigié
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Aspects moleculaires et cellulaires de la biologie
• Date : Soutenance le 16/10/2023
• Etablissement(s) : Normandie
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Normande de biologie intégrative, santé, environnement (Mont-Saint-Aignan, Seine-Maritime)
• Partenaire(s) de recherche : établissement co-accrédité : Université de Caen Normandie (1971-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Biologie, génétique et thérapies ostéoarticulaires et respiratoires (Saint-Contest, Calvados ; 2017-....)
• Jury : Président / Présidente : Johanne Leroy-Dudal
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Émeline Perrier-Groult, Jean-Thomas Vilquin, Frédéric Cassé, Romain Contentin, Claire Vinatier
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Émeline Perrier-Groult, Jean-Thomas Vilquin

Mots clés

Mots clés contrôlés

Cytokines

Sécrétome

Exosomes

Chondrocytes

Cellules stromales mésenchymateuses

Cheval -- Maladies

Arthrose

Mots clés libres

Cartilage

Osteoarthritis

Horse

Mesenchymal stem cells

Extracellular vesicles

Pro-inflammatory cytokines

Secretome

Résumé

Le cartilage hyalin est un tissu conjonctif recouvrant les extrémités des os et assurant le bon fonctionnement des articulations synoviales. Au cours du vieillissement ou suite à des traumatismes physiques, le cartilage peut subir des lésions et se dégrader progressivement, menant au développement de l’arthrose dont les symptômes se manifestent sous la forme de douleurs, de gonflements et de l’inflammation de l’articulation. Du fait de l’exposition des chevaux à des compétitions sportives intenses et fréquentes, l’arthrose est fortement prévalente dans la filière équine, entraînant l’altération du bien-être animal ainsi que d’importantes pertes économiques. Actuellement, seuls des traitements palliatifs sont disponibles, cependant, l’utilisation du sécrétome de cellules souches mésenchymateuses de moelle osseuse (CSM-MO) émerge comme une solution thérapeutique innovante tout en s’affranchissant de certaines contraintes liées aux thérapies cellulaires. Définit comme l’ensemble des particules et éléments bioactifs sécrétés par les cellules, le sécrétome contient également des nanovésicules extracellulaires (nVE) dont une catégorie, les exosomes, présente une composition et des capacités de vectorisation séduisantes pour la régénération du cartilage. Dans ce contexte, les objectifs de ces travaux de thèse étaient de produire, caractériser et évaluer le potentiel du sécrétome des CSM-MO équines, ainsi que de leurs nVE, pour la régénération des lésions chondrales chez le cheval. Premièrement, nous avons collecté le sécrétome de CSM-MO équines en culture monocouche via la production de milieux conditionnés (MC). Ces MC ont permis de favoriser in vitro la migration des chondrocytes et d’augmenter la synthèse des collagènes de types I, II et IIB dans des organoïdes cartilagineux in vitro. Par la suite, trois cytokines pro-inflammatoires équines (IL-1β, TNF-α et IFN-γ) ont été utilisées pour stimuler les propriétés immunomodulatrices des CSM. Le traitement des chondrocytes par du MC obtenu après le priming des CSM par de l’IL-1β et du TNF-α a permis d’induire l’accumulation des collagènes I et IIB dans la matrice extracellulaire, tandis que l’IFN-γ a entraîné une diminution de leur expression. À l’inverse, le niveau des ARNm de certaines protéases matricielles s’est vu diminué lorsque le MC était obtenu après priming par l’IFN-γ et augmenté lors du priming par les deux autres cytokines. L’utilisation thérapeutique des exosomes étant plus avantageuse que celle du sécrétome complet, nous avons ensuite purifié les exosomes de CSM-MO par capture par membrane d’affinité (MAC) et chromatographie par exclusion de taille (SEC). La MAC a permis d’obtenir un rendement plus important que la SEC, malgré une plus faible pureté des exosomes. De plus, les exosomes isolés par MAC ont démontré un meilleur potentiel pour l’amélioration du phénotype chondrocytaire de type hyalin. La modulation de ce potentiel via le priming des CSM a révélé des effets spécifiques à chaque type d’exosomes. Ces travaux initient le développement de stratégies innovantes basées sur le sécrétome et les exosomes de CSM-MO pour la régénération du cartilage et le traitement de l’arthrose équine. Au vu des similitudes partagées par les articulations humaines et équines, ces études initiées chez le cheval ouvrent de vastes perspectives thérapeutiques en médecine clinique selon les préceptes du concept « One Health ».

Hyaline cartilage is a connective tissue that covers the bone extremities and plays a crucial role in the proper function of synovial joints. During aging or as a result of physical trauma, the cartilage can be damaged and gradually degrade, leading to the development of osteoarthritis characterized by joint pain, swelling, and inflammation. Due to the exposure of horses to intense and frequent sport competitions, osteoarthritis is highly prevalent in the equine industry, resulting in impaired animal welfare and significant economic losses. Currently, only palliative treatments are available. However, the use of the secretome of bone marrow-derived mesenchymal stem cells (BM-MSCs) emerges as an innovative therapeutic solution that overcomes certain limitations inherent to cellular therapies. Defined as the whole bioactive particles and elements secreted by cells, the secretome also contains extracellular nanovesicles (EVs), including a specific category commonly called exosomes, which possess attractive composition and vectorization properties in cartilage regenerative medicine. In this context, the aims of this thesis work were to produce, characterize, and evaluate the potential of the secretome of equine BM-MSCs, as well as their EVs, for the regeneration of chondral lesions in horses. Firstly, we collected the secretome of equine BM-MSCs in monolayer culture through the production of conditioned media (CM). These CM facilitated the in vitro migration of chondrocytes and increased the synthesis of type I, II, and IIB collagens in cartilaginous organoids in vitro. Subsequently, three equine pro-inflammatory cytokines (IL-1β, TNF-α, and IFN-γ) were used to stimulate the immunomodulatory properties of BM-MSCs. Treating chondrocytes with CM obtained after priming BM-MSCs with IL-1β and TNF-α induced the accumulation of type I and IIB collagens in the extracellular matrix, while IFN γ resulted in their decreased expression. Conversely, the mRNA level of certain matrix proteases was decreased when CM was obtained after priming with IFN-γ and increased when the two other cytokines were used for priming. Considering the therapeutic advantages of exosomes compared to the complete secretome, we then purified BM-MSC exosomes using membrane affinity capture (MAC) and size exclusion chromatography (SEC). MAC provided a higher yield than SEC, despite lower exosome purity. Interestingly, exosomes isolated by MAC demonstrated a greater potential in improving the hyaline-like chondrocyte phenotype. Modulation of this potential through CSM priming revealed specific effects for each type of exosome. These findings initiate the development of innovative strategies based on the secretome and exosomes of BM-MSCs for cartilage regeneration and the treatment of equine osteoarthritis. Considering the similarities between human and equine joints, these studies initiated in horses open wide therapeutic perspectives in clinical medicine following the principles of the "One Health" concept.