Étude des Propriétés Dynamiques des Protéines Intrinsèquement Désordonnées en Milieu Complexe par Résonance Magnétique Nucléaire et Modélisation Moléculaire

Studying the Dynamic Properties of Intrinsically Disordered Proteins in Complex Environments by Nuclear Magnetic Resonance and Molecular Modeling

• Auteur / Autrice : Vincent Schnapka
• Direction : Martin Blackledge
• Type : Projet de thèse
• Discipline(s) : Physique pour les Sciences du Vivant
• Date : Inscription en doctorat le ; Soutenance le 20/12/2023
• Etablissement(s) : Université Grenoble Alpes
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale physique
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Institut de biologie structurale (Grenoble)
• Partenaire(s) de recherche : Equipe de recherche : Groupe flexibilité et dynamique des proteines par RMN
• Jury : Président / Présidente : Marc Jamin
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Mikael Akke, Stephan Grzesiek, Massimiliano Bonomi, Guillaume Bouvignies
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Mikael Akke, Stephan Grzesiek

Mots clés

Mots clés libres

Résonance Magnétique Nucléaire

Modélisation Moléculaire

Dynamique des Protéines

Protéines Intrinsèquement Désordonnées

Séparation de Phase Liquide-Liquide

Nuclear Magnetic Resonance

Molecular Modeling

Protein Dynamics

Intrinsically Disordered Proteins

Liquid-Liquid Phase Separation

Résumé

Les Protéines Intrinsèquement Désordonnées représentent un tiers du protéome humain et sont impliquées dans un grand nombre de mécanismes biologiques comme la signalisation cellulaire et la formation de compartiments sans membrane vitaux pour la cellule en plus d'être impliquées dans de nombreuses maladies et infections virales. Etant donné qu'elles n'ont pas de structure stable, leurs propriétés dynamiques jouent un rôle important dans leur fonction biologique. Malgré le fait que la caractérisation in vitro de ce type de protéines est relativement bien établie, leur comportement dans des conditions physiologiques comme l'environement cellulaire incluant les compartiments sans membrane générés par séparation de phase liquide-liquide, hautement concentrés en protéines et macromolécules, est encore mal compris. Dans cette thèse, la partie C-terminale de la Nucléoprotéine du virus de la rougeole est utilisée en tant que modèle pour étudier les propriétés dynamiques de cette prototypique protéine désordonnée en phase condensée générée par séparation de phase liquide-liquide ainsi qu'en milieu encombré par Résonance Magnétique Nucléaire et simulation de Dynamique Moléculaire. Dans un premier temps, il est montré que la séparation de phase liquide-liquide augmente les temps de corrélation rotationels associés à la dynamique du skelette peptidique de la protéine et que la contribution de chaque mode dynamique est significativement redistribuée. Les simulations de protéines concentrées ont montré que cette redistribution observée en phase condensée est correlée avec l'augmentation de la proximité non spécifique des chaines protéiques les unes avec les autres, conduisant à des mouvements plus restreints dans le skelette peptidique. La relaxation RMN de spin a aussi montré que les ralentissements de la dynamique au niveau de certains segments peptidiques sont correlés avec un taux élevé de résidus chargés et aromatiques, ce qui suggère une forte importance de ces résidues et de leurs interactions dans la stabilisation de cette phase condensée en accords avec d'autres études. Une construction plus courte de la partie C-terminale de la Nucléoprotéine du virus de la rougeole a été utilisée pour étudier les effets de l'encombrement avec du PEG10000, un polymère à longe chaine, à des concentrations qui approchent celles de certains milieux cellulaires et des phases condensées. La relaxation de spin a montré que ce tres haut niveau d'encombrement avait pour effet de redistribuer les modes dynamiques de façon semblable a ce qui a été observé en phase condensée, suggérant que des milieux suffisament encombrés pourraient modifier les propriétés dynamiques de certaines protéines intrinsèquement désordonnées. Enfin, une interaction protéine-protéine entre cette construction et son partenaire, la partie C-terminale de la phosphoprotéine du virus de la rougeole, a été étudiée en milieu encombrée. Un ralentissement important des propriétés cinétiques de cette interaction est observée et une étude plus poussée de cette interaction devrait contribuer à une meilleure compréhension à l'échelle atomique des effets de l'encombrement sur les interactions entre protéines, cruciaux pour les processus biologiques. Cette étude apporte un aperçu de l'effet de l'encombrement sur la dynamique des protéines intrinsèquement désordonnées et est une étape supplémentaire vers une meilleure compréhension du comportement de cette classe importante de protéines dans les environements physiologiques incluant les compartiments sans membranes, omniprésents chez les cellules eukariotes et les machineries virales.

Intrinsically Disordered Proteins represent a third of the human proteome and are involved in countless biological mechanisms from cell signalling to the formation of vital membraneless organelles in the cells as well as playing a role in numerous diseases and viruses. Since they lack a stable 3D structure, their dynamic properties play an important role in their biological functions. While characterizing this class of proteins in vitro is well established, their behavior in more physiological conditions from the crowded cellular milieu to the highly concentrated liquid-liquid phase separated membraneless organelles is poorly understood. In this thesis, we use the C-terminal domain of the Nucleoprotein of Measles Virus as a model system to investigate the dynamic properties of this prototypical disordered protein in its liquid-liquid phase separated condensed phase as well as in crowded environments using Nuclear Magnetic Resonance and Molecular Dynamics Simulations. We first show that liquid-liquid phase separation increases the rotational correlation times associated with the backbone dynamics of the protein and that the contribution of local and long-range motional modes is significantly redistributed. MD simulations of concentrated proteins suggest that this redistribution is correlated with the increase of non-specific intermolecular proximity or entanglement within the concentrated phase, leading to more restricted motions within the protein's backbone. NMR spin relaxation also showed that the distribution of slower segmental motions is correlated with the position of charged and aromatic residues in some regions, suggesting that the phase separation of our protein is stabilized by electrostatic and cation-pi interactions, in agreement with previous proposals. A shorter construct of the Measles C-terminal domain of the Nucleoprotein was further studied upon crowding with a high molecular weight PEG10000 polymer up to concentrations that correspond to those found in biomolecular condensates. NMR spin relaxation measurements showed that high levels of macromolecular proximity in super-crowded conditions redistributes the dynamic modes of the protein backbone in a way that is not observed at lower levels of crowding, suggesting that significantly crowded conditions can modify the dynamic properties of certain IDPs. Finally, a protein-protein interaction between this construct and its partner in the C-terminal domain of the Measles Virus Phosphoprotein was studied upon crowding and exhibited a significant slow down of the kinetic properties of the interaction. Further studies of this interactions by NMR should contribute to a better understanding of the atomic-resolution effects of crowding on protein-protein interactions, crucial for biological processes. This study provides insight into the effect of crowded environments on the backbone dynamics of Intrinsically Disordered Proteins and is a step towards a better understanding of how this crucial class of proteins behave in more physiological environments including the currently actively studied membrane-less organelles, ubiquitous in eukariotic cells and viral machineries.