SIGNALER une erreur

Caractérisation de la production du VIH-1, de la Grippe et de SARS-CoV-2 en présence de petites molécules ciblant les cofacteurs d'actine de la cellule hôte

par Manon Gourdelier

Thèse de doctorat en Biologie Santé

Sous la direction de Delphine Muriaux.

Thèses en préparation à l'Université de Montpellier (2022-….) , dans le cadre de Sciences Chimiques et Biologiques pour la Santé (Montpellier ; Ecole Doctorale ; 2015-....) , en partenariat avec IRIM - Institut de Recherche en Infectiologie de Montpellier (laboratoire) et de Domaines membranaires et assemblage viral (equipe de recherche) .


  • Résumé

    La circulation persistante du VIH-1 et du virus de la grippe A pandémique 2009, ainsi que l'émergence récente du nouveau coronavirus SARS-CoV-2, qui est rapidement devenu une pandémie, préoccupe la recherche biomédicale pour le développement de traitements antiviraux ou de vaccins. Afin de développer de nouvelles thérapies antivirales visant les étapes de formation de la particule virale, il est nécessaire de comprendre les mécanismes moléculaires et cellulaires impliqués dans l'assemblage et le bourgeonnement de ces virus. Au cours de ma thèse, je me suis intéressée à l'assemblage des particules virales de 3 virus : le VIH-1, le virus de la grippe A (IAV) et le SARS-CoV-2. Ces virus étant des virus bourgeonnant des membranes de la cellule hôte, l'actine corticale représente un candidat intéressant et est souvent impliquée dans le cycle viral. La régulation du cytosquelette d'actine nécessite plusieurs protéines cellulaires de régulation qui pourraient aider à la production des particules virales. Ainsi, les objectifs de ma thèse ont été de comprendre le rôle des protéines régulatrices de l'actine, la cofiline et son cofacteur WDR1, dans l'assemblage et la libération des particules virales. Ces facteurs de l'actine ont pour rôle de reconnaitre les filaments d'actine pour les casser. Nous avons ainsi étudié le rôle du complexe cofiline/WDR1 sur la production des virions dans un cadre infectieux dans leurs cellules cibles sans différencier les étapes précoces et tardives, ainsi qu'à l'aide d'un système minimal non infectieux de production de VLPs, permettant de contourner l'entrée virale. Le but était de comparer 3 virus dont le VIH-1 et la Grippe qui bourgeonnent à la membrane plasmique des cellules infectées tandis que SARS-CoV-2 s'assemble et bourgeonne à la membrane du ERGIC avant d'être sécrété. Pour ce faire, dans un premier temps, j'ai mis en place le système de production des VLPs SARS-CoV-2. Nous avons développé les VLPs SARS-CoV-2 basées sur un ratio de plasmides optimal imitant le ratio des ARN viraux issus de la transcriptomique. Nous montrons que le système minimal nécessaire à la formation des VLPs requiert les protéines structurales M, N et E (avec ou sans S) du SARS-CoV-2. Nous avons aussi créé des VLPs fluorescentes et caractérisé ces VLPs par différentes techniques de microscopie pour confirmer leur taille, nombre et l'incorporation de M, N et la spike S dans ces VLPs. Dans un deuxième temps, j'ai étudié le rôle des protéines régulatrices de l'actine, WDR1 et cofiline, dans la production des VLPs de ces 3 virus et sur virus infectieux. En utilisant des siRNAs, nous avons montré que lors de l'absence de WDR1, la production des particules du VIH-1 et de IAV augmente contrairement à la production de VLPs SARS-CoV-2 qui diminue. De plus, une augmentation de la production de ces VLPs a été montré par l'utilisation de la drogue R10015 ciblant la kinase LIMK1 et menant à l'inhibition de la phospho-cofiline. Par immunoprécipitation, nous avons montré que Gag du VIH-1 est capable de former un complexe intracellulaire avec WDR1 à la membrane plasmique. De même, IAV-M1, est capable de former un complexe intracellulaire avec la cofiline. Pour SARS-CoV-2, la protéine transmembranaire M forme un complexe intracellulaire avec la cofiline. Ceci suggère un rôle général de l'actine dans l'assemblage et la libération des particules de ces virus. Enfin, en utilisant la microscopie confocale sur des cellules produisant des VLPs, nous avons observé un réarrangement des fibres d'actine, dont WDR1 et la cofiline pourraient être des acteurs. En conclusion, les régulateurs de l'actine, cofiline et WDR1, sont impliqués dans la production des virions du VIH-1 et de la grippe ainsi que des VLPs Gag, IAV et SARS-CoV-2. Les résultats de l'étude suggèrent une nécessité de la présence de la F-actine stabilisée pour la production du VIH-1 et de la grippe tandis que SARS-CoV-2 requiert une dépolymérisation (cassure) de l'actine filamenteuse.

  • Titre traduit

    Characterization of HIV-1, Influenza and SARS-CoV-2 production in the presence of small molecules targeting host cell actin cofactors


  • Résumé

    The persistent circulation of the human immunodeficiency virus (HIV-1) and the 2009 pandemic influenza A virus, as well as the recent emergence of a new coronavirus named SARS-CoV-2, which has rapidly become a pandemic, is of concern to biomedical research for the development of antiviral treatments or vaccines. To develop new antiviral therapies targeting the formation stages of the viral particle, it is necessary to understand the molecular and cellular mechanisms involved in the assembly and budding of these viruses. During my thesis, I was interested in the assembly of viral particles of 3 viruses: HIV-1, influenza A virus (IAV), and SARS-CoV-2. As these viruses are viruses budding from host cell membranes, cortical actin is an interesting candidate and is often involved in the viral cycle. The regulation of the actin cytoskeleton requires several cellular regulatory proteins that could help in the production of viral particles. Thus, the objectives of my thesis were to understand the role of actin regulatory proteins, cofilin and its cofactor WDR1, in viral particle assembly and release. The role of these actin factors is to recognize actin filaments and break them. We studied the role of the cofilin/WDR1 complex on the production of virions in an infectious setting in their target cells without differentiating early and late stages, as well as using a minimal non-infectious system of VLP production, allowing to bypass viral entry. The goal was to compare 3 viruses including HIV-1 and Influenza that bud at the plasma membrane of infected cells while SARS-CoV-2 assembles and buds at the ERGIC membrane before being secreted. To do this, in the first step, I set up the production system of SARS-CoV-2 VLPs. We developed the SARS-CoV-2 VLPs based on an optimal plasmid ratio mimicking the ratio of viral RNAs from transcriptomics. We show that the minimal system required for VLPs formation requires the SARS-CoV-2 structural proteins M, N, and E (with or without S). We also created fluorescent VLPs and characterized these VLPs by different microscopy techniques to confirm their size, number and the incorporation of M, N and spike S into these VLPs. HIV-1 VLP-Gag and IAV VLPs had already been developed in the team. In a second step, I studied the role of actin regulatory proteins, WDR1 and cofilin in the production of VLPs of these 3 viruses and on infectious viruses. Using siRNA, we showed that in the absence of WDR1, the production of HIV-1 and IAV particles increases while the production of SARS-CoV-2 VLPs decreases. Furthermore, an increase in the production of these VLPs was shown using the LIMK1 kinase targeting drug R10015 leading to the inhibition of phospho-cofilin. By immunoprecipitation, we showed that HIV-1 Gag can form an intracellular complex with WDR1 at the plasma membrane. Similarly, IAV-M1, which like HIV-1 Gag binds to plasma membrane phospholipids, can form an intracellular complex with cofilin. For SARS-CoV-2, the M transmembrane protein forms an intracellular complex with cofilin. This suggests a general role for actin in the assembly and release of particles of these viruses. Finally, using confocal microscopy on VLPs producing cells, we observed a rearrangement of actin fibers, of which WDR1 and cofilin could be players. In conclusion, the actin regulators cofilin and WDR1 are involved in the production of HIV-1 and influenza virions as well as Gag, IAV and SARS-CoV-2 VLPs. The results of the study suggest a requirement for the presence of stabilized F-actin for HIV-1 and influenza production while SARS-CoV-2 requires more depolymerization (breakage) of filamentous actin.