Analyse de la Morphologie Bactérienne par Imagerie Corrélative cryo-SXT/cryo-STEM

par Antoine Cossa

Projet de thèse en Physique

Sous la direction de Véronique Arluison et de José María Carazo.

Thèses en préparation à université Paris-Saclay en cotutelle avec l'Université Autonome de Madrid , dans le cadre de École doctorale Sciences chimiques : molécules, matériaux, instrumentation et biosystèmes , en partenariat avec Laboratoire Léon Brillouin (laboratoire) et de Faculté des sciences d'Orsay (référent) depuis le 01-10-2019 .


  • Résumé

    La cryo-microscopie électronique est une méthode d'imagerie haute-résolution qui permet d'observer les échantillons biologiques. L'échantillon est déposé sur une grille en cuivre recouverte d'un film de carbone à trous. L'échantillon est ensuite congelé dans les films minces d'eau qui se forment dans les trous du carbone. La congélation dans l'éthane liquide refroidi à une température d'environ -175°C par de l'azote liquide permet de conserver l'échantillon dans un état proche de l'état natif. La conservation de l'échantillon est telle que dans le cas de protéines, différents états de conformation sont accessibles, les mécanismes moléculaires peuvent donc être étudiés. La microscopie électronique à transmission (TEM) consiste à collecter une image de projection de l'objet d'intérêt en utilisant un faisceau « large » dont le diamètre est supérieur à la taille de la caméra qui sert à acquérir les images. Deux processus sont à l'origine du contraste obtenu sur les images. Le premier processus, lié à la nature corpusculaire des électrons, est le contraste d'amplitude, il correspond au nombre d'électrons qui atteignent la caméra, les atomes lourds générant plus de contraste d'amplitude que les atomes légers. Dans le cas des échantillons biologiques, les atomes en présence sont légers et la faible différence du numéro atomique (Z) génère un très faible contraste d'amplitude. Le second processus mis en jeu dans la génération du contraste est lié à la nature ondulatoire des électrons. Les ondes électroniques arrivent en phase sur l'échantillon, mais après avoir subi des diffusions en traversant l'échantillon, les ondes arrivent déphasées au niveau de la caméra et produisent des interférences destructrices qui ne permettent pas de générer du contraste. Pour générer du contraste, on modifie la force de la lentille électromagnétique objectif qui permet de rephaser les ondes, entraînant des interférences constructrices et donc du contraste à certaines fréquences. Ce mode de microscopie permet de collecter des images très haute résolution sur des échantillons fins. Dans le cas des échantillons épais, les ondes électroniques subissent plusieurs processus de diffusion et il n'est alors plus possible de rephaser les ondes. Le seuil à partir duquel on considère qu'un échantillon est épais se situe à environ 300 nm, valeur variable en fonction de la tension d'accélération des électrons (un microscope à 200kV ne pourra pas observer des échantillons aussi épais qu'un microscope opérant à 300kV). Une alternative à la TEM est la microscopie électronique à transmission en mode balayage (STEM). Il s'agit toujours de collecter une image de projection de l'échantillon, mais en STEM, le faisceau est focalisé sur l'échantillon en une sonde de très faible dimension (de l'ordre du nm), puis cette sonde est balayée à la manière du cantilever d'un microscope à force atomique ou du laser d'un microscope à fluorescence confocal. L'échantillon est donc imagé point par point (pixel par pixel) et le faisceau arrive sur un détecteur qui agit comme un compteur d'électrons. Dans ce mode de microscopie, le processus de formation des images n'utilise que la nature corpusculaire des électrons, et le contraste obtenu est proportionnel au Z² ce qui même dans le cas d'atomes légers permet de générer des images avec un contraste relativement fort. De plus, puisqu'il n'est pas dépendant de la phase, le STEM n'est pas aussi sensible que le TEM à l'épaisseur des échantillons. En STEM, il est possible d'imager en 3D et à la résolution nanométrique des échantillons biologiques d'environ 1µm d'épaisseur. En parallèle, la cryo-tomographie rayons-X mous (SXT - rayonnement synchrotron) permet d'étudier à une résolution d'environ 30 nm en 3D des échantillons biologiques de plusieurs µm d'épaisseur fixés dans un état de conservation proche de l'état natif. Comme en cryo-EM, cette méthode fait intervenir la congélation d'un échantillon dans l'éthane liquide refroidit par de l'azote liquide sur une grille de microscopie électronique. Cette méthode est relativement récente, expliquant pourquoi le nombre d'études est pour l'instant faible. Des développements sont en cours, comme la possibilité de collecter des données tiltées selon deux axes de tilt (tomographie double-tilt). Cette méthode est très intéressante car elle permet de mieux échantillonner en 3D l'objet d'intérêt, et donc ainsi reconstruire un volume 3D de meilleure qualité et avec une résolution plus isotrope. L'énergie des rayons-X mous peut être définie de manière à mettre en évidence différents atomes dans l'échantillon. Ainsi, les images sont le plus souvent collectées dans la fenêtre dite « de l'eau », ce qui permet d'observer les atomes H, C et N, mais de ne pas « voir » les atomes O. Ceci a un avantage certain quand on observe un échantillon cryo puisque l'eau (H2O) représente une grande partie des atomes en présence. Les éléments cellulaires comme l'ADN peuvent donc être observés avec un fort contraste, ce qui n'est pas le cas en TEM. La cryo-ET et la cryo-SXT sont donc deux méthodes complémentaires en termes de résolution et de structures observées, le processus de formation des images et l'origine du contraste étant différents. Cependant, la préparation d'échantillon est strictement identique et les problématiques de congélation sont partagées. Les récentes études faisant appel aux méthodes corrélatives, en particulier la CLEM (correlative light and electron microscopy), ont montré les avantages importants liés à la combinaison de différentes méthodes d'imagerie. En CLEM, la structure d'intérêt présente au sein d'une cellule est d'abord ciblée et localisée par microscopie à fluorescence puis la cellule est amincie (cryo-FIB milling) de manière à isoler la structure d'intérêt et enfin pouvoir collecter des images de bonne qualité au microscope électronique. Récemment, dans le cadre d'une collaboration entre le LLB/CEA-Saclay, l'Institut Curie à Orsay et le synchrotron Soleil, nous nous sommes rendus au synchrotron Alba (Barcelone, Espagne) pour réaliser des expériences de cryo-SXT afin d'étudier l'état de compaction de l'ADN chez la bactérie E. coli. Lors des expériences, nous avons pu prendre en main les éléments techniques de la méthode (fixation de la grille sur le porte-objet, conditions de collecte, dommages sur l'échantillon liés à la dose en rayons-X, etc.). Dès cette première expérience de SXT, l'intérêt d'un projet d'étude corrélative SXT/cryo-STEM afin de caractériser l'échantillon biologique plus en profondeur s'est avéré évident. La SXT nous permet de voir l'ADN, mais la résolution étant limitée à environ 30 nm, l'ajout d'une seconde information structurale à plus haute résolution (celle de la cryo-tomographie STEM) permettrait de mieux définir et décrire les zones dans lesquelles l'ADN est compacté. Cette méthode permettrait en outre d'imager précisément la double membrane de la bactérie Gram(-) et même le peptidoglycane, ce que ne permet pas la résolution de la SXT. C'est sur la combinaison de ces 2 méthodes en vue d'imager les structures internes des bactéries que porte le projet de thèse.

  • Titre traduit

    Bacterial Morphology Analysis by cryo-SXT/cryo-STEM Correlative Imaging


  • Résumé

    Cryo-electron microscopy is an imaging tool capable to observe biological samples at high-resolution. The sample is deposited on a copper grid covered by a holey carbon film. Then, the sample is frozen inside thin ice layers formed in the holes of the carbon film. The freezing performed at high speed in liquid ethane cooled down at -170°C by liquid nitrogen allows the conservation of the sample in a close to native state. The sample integrity is conserved so that conformation states are visible after data analysis of the images collected at the electron microscope, molecular mechanisms can be studied. Transmission electron microscopy (TEM) aims at collecting projection images of an object of interest using a wide electron beam. The origin of the contrast comes from two types of interactions of the electrons with the matter. The first interaction is linked to the particle entity of the electrons, it is the amplitude contrast, it corresponds to the number of electrons reaching the camera, heavy atoms generating more contrast that light ones. In the case of biological samples, atoms are relatively light, the contrast is usually weak. The second origin of the contrast comes from the wave entity of the electrons. When electron waves, emitted in phase, reach and traverse the sample, they suffer scattering that break the phase, generating destructive interferences at the level of the camera. To generate contrast the intensity of the electromagnetic lens of the microscope can be modified to put the electron waves back in phase. This imaging mode allows to collect high-resolution images of thin samples. In the case of thick samples, electron waves are so much scattered that they cannot be put back into phase. The threshold at which a sample is considered too thick to be observed by TEM is about 300 nm, depending on the acceleration voltage of the electrons. An alternative to TEM is scanning transmission electron microscopy (STEM). In STEM, a projection image of the sample is still collected, however, the raster electron beam is focused on the sample (about 1 nm or less), similarly to what is performed in confocal laser imaging. The sample is scanned point by point and the transmitted electron beam is collected on a detector acting as an electron counter. In STEM, the contrast originates from the particle entity of the electron only, and is proportional to Z² of the atom, generating contrast even with light atoms. STEM is an incoherent imaging mode, it not depending on the phase of the electron, hence it is less sensitive to the sample thickness than TEM. In STEM, it is possible to observe in 3D biological sample of about 1 µm. Cryo-soft X-ray tomography (SXT - synchrotron radiation) allows to study in 3D biological samples of several microns of thickness at about 30 nm resolution in close to native state. Similarly to cryo-TEM, the sample is deposited on a copper carbon-coated grid and plunge-frozen in liquid ethane. This is a very recent method, only available at a few synchrotrons over the world. Technological developments are currently being made such as the possibility to collect 3D data along 2 axes (double-tilt tomography). This method, already existing in electron microscopy, allows a better sampling of the object of interest in 3D, the reconstructed volume is more isotropic in resolution. Energy of X-rays can be modified so that different kind of atoms of the sample can be observed. Images are often collected in the water window, enabling a clear discrimination of atoms H, C and N without collecting the signal of atoms O. This is a substantial advantage when the sample is embedded into ice (H2O). Sub-cellular components of cells, such as nucleoid can be observed with strong contrast. Cryo-ET and cryo-SXT are two complementary methods in terms of resolution and types of structures observables since the origin of the contrast is different in both methods. Moreover, sample preparation is strictly the same. Recent studies using correlative approaches, more particularly CLEM (correlative light and electron microscopy), have shown their strong advantages of combining several methods of investigation. In recent CLEM studies, the structure of interest is located in cellulo using fluorescence microscopy, then the thickness of the cell is reduced (cryo-FIB milling) so that quality images of the isolated structure of interest can be collected at the electron microscope. In a recent collaboration between LLB/CEA-Saclay, Institut Curie Orsay and synchrotron Soleil, we went to synchrotron Alba (Barcelona, Spain) to perform cryo-SXT experiments to study the compaction state of DNA in E. coli. During the experiments, we saw the technical tips (grid fixation on the holder, data collection, beam damages on the sample) and the imaging results of the method. Very rapidly we saw the advantages of a correlative study cryo-SXT/cryo-STEM to better characterize the DNA in our samples. SXT will allow to visualize DNA at a resolution limited to 30 nm, and the addition of a better resolved 3D map (the one cryo-STEM tomography) will allow to better define and describe the zones of the bacteria in which the DNA is compacted. This method should allow to accurately image the double membrane and even the peptidoglycan, that is not allowed by the resolution reached by SXT. The PhD project will consist in the development of the combination of these two methods to image bacteria internal structure.