Virus influenza aviaires : analyse du risque d'évolution vers les formes hautement pathogènes

Avian influenza viruses : analysis of the risk of evolution towards highly pathogenic forms

• Auteur / Autrice : Gabriel Dupré
• Direction : Romain Volmer, Stéphane Bertagnoli
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Infectiologie, Physipoathologie, Toxicologie, Génétique et Nutrition
• Date : Soutenance le 23/06/2023
• Etablissement(s) : Toulouse, INPT
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Sciences écologiques, vétérinaires, agronomiques et bioingénieries (Toulouse)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Interactions Hôtes - Agents Pathogènes (Toulouse ; 2003-....)
• Jury : Président / Présidente : Christophe Pasquier
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Romain Volmer, Stéphane Bertagnoli, Sébastian Lequime
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Sophie Le Poder, Catherine Isel

Mots clés

Mots clés contrôlés

ARN

Grippe aviaire

Mots clés libres

Influenza

Évolution

Virus

Aviaire

Influenza

Evolution

Virus

Avian

Résumé

Les virus de l'influenza aviaire (AIV) constituent une menace importante pour la santé animale et humaine. Ces virus peuvent être classés en deux groupes en fonction de leur pathogénicité observée chez les volailles. Certains virus influenza aviaires faiblement pathogènes (LPAIV) de sous-types H5 ou H7 ont la capacité d'évoluer et d'acquérir une séquence polybasique dans le site de clivage de l'hémagglutinine (HA), ce qui a pour effet d’augmenter considérablement leur pathogénicité, permettant ainsi l’émergence de virus influenza aviaire hautement pathogène (HPAIV). Le mécanisme génétique de cette évolution est mal compris et certaines questions restent sans réponse. Est-ce que tous les LPAIV ont-ils la même probabilité d'évoluer vers un phénotype hautement pathogène ? Si la probabilité d'émergence d’HPAIV est différente parmi les LPAIV, existe-t-il des caractéristiques spécifiques sur le segment génomique HA qui peuvent influencer l'évolution LPAIV/HPAIV ? Plusieurs études ont suggéré qu’une structure secondaire d’ARN conservée de type tige-boucle d'ARN, située dans la région codant le site de clivage HA, pourrait être impliquée dans l'évolution LPAIV/HPAIV. Dans cette thèse, nous avons étudié la présence possible d'éléments génomiques viraux pouvant influencer les taux de mutation de la polymérase virale, ce qui pourrait potentiellement conduire à l'émergence de HPAIV. Tout d'abord, une analyse phylogénétique des séquences nucléotidiques HA du sous-type H5/7 du virus de l'influenza aviaire, combinée à des prédictions de structures secondaires de l'ARN, a été réalisée pour révéler les motifs structurels potentiels impliqués dans la transition LPAIV/HPAIV. Grâce à cette approche bioinformatique, l'analyse par clustering des structures d'ARN prédites, associée aux données phylogénétiques, a révélé que la plupart des ancêtres ayant conduit à l'émergence d’HPAIV par recombinaison partagent la même structure prédite d'ARN au niveau de la région HA1/HA2. Cette structure d’ARN pourrait favoriser la recombinaison génétique, conduisant à l'acquisition d'un motif de clivage HA polybasique. De plus, aucune corrélation n'a été identifiée entre la stabilité thermodynamique de la structure ARN conservée et l'émergence du virus HPAIV. Ensuite, nous avons mis au point un système de génétique inverse permettant de générer des virus H7N1 contenant une autre séquence HA complète sous la forme d'un transgène situé à l'extrémité du segment codant pour la protéine PA virale. Dans ce modèle, la séquence transgénique HA insérée ne peut être traduite et est libérée de toute pression de sélection sur la fonction protéique, permettant ainsi d’étudier l’influence de tous les types d’environnement nucléotidique sur les erreurs de la polymérase virale. Nous avons réussi à produire et à caractériser plusieurs virus contenant des transgènes avec motifs différents au niveau de la région codant le site de clivage HA. En utilisant ce système lors d’infections expérimentales, suivi de séquençage profond du transgène, nous avons étudié comment différents environnements nucléotidiques pouvaient influencer le taux d'erreur de la polymérase virale. Nous avons pu identifier un motif nucléotidique minimal favorable aux événements d'insertion et de substitution pouvant conduire à l’acquisition d’un site de clivage HA polybasique, et donc à l’émergence HPAIV. De plus, plusieurs événements de recombinaison avec l'ARN ribosomal et des segments viraux ont été observés avec notre système. Ce travail permet de mieux comprendre les éléments génétiques viraux qui influencent les erreurs de la polymérase virale et l'émergence de l'HPAIV.

Avian influenza viruses (AIV) constitute a significant threat to both animal and human health. These viruses can be distinguished into two groups in terms of their observed pathogenicity in poultry. Some low pathogenic influenza viruses (LPAIV) of H5 or H7 subtypes have the ability to evolve and acquire a polybasic sequence in the hemagglutinin (HA) cleavage site, which will enhance their pathogenicity and be responsible for the emergence of highly pathogenic avian influenza viruses (HPAIV). The genetic mechanism of this evolution is poorly understood, and some questions remain unanswered. Within the H5 and H7 subtypes, have all the LPAIV the same probability to evolve towards a highly pathogenic phenotype? If the probability of HPAIV emergence among LPAIV is significantly different, are there specific features on the HA genomic segment that can influence the evolution to HPAIV? Several studies suggested that specific determinants of a conserved RNA stem-loop located at the HA cleavage site-encoding region could influence the LPAIV-to-HPAIV evolution. In this thesis, we investigated the possible presence of viral genomic elements that can influence the viral mutation rates, which could potentially lead to HPAIV emergence. First, a phylogenetic analysis of HA nucleotide sequences of H5/7 subtype-AIV from avian hosts combined with RNA-secondary structures predictions was performed to reveal potential structural motifs involved in LPAIV/HPAIV transition. Thanks to this bioinformatics approach, RNA structure clustering analysis coupled with phylogenetic data revealed that most of the ancestors leading to H7-HPAIV emergences via recombination shared the same viral RNA structure at the HA1/HA2 boundary region. The identified shared predicted RNA structure present in the HA of H7 viruses could promote genetic recombination, leading to the acquisition of HA polybasic cleavage site motif. Moreover, no correlation was identified between the thermodynamic stability of the conserved RNA structure and HPAIV emergence. We developed a reverse-genetic system that generates H7N1 influenza viruses harbouring a full HA sequence as a transgene located at the end of the PA encoding segment. In this model, the inserted HA sequence cannot be translated and is released from any selection pressure at the level of protein function. We successfully rescued and characterized infectious viruses containing transgene with various HA cleavage site encoding motifs. Using this system and deep-sequencing, we tested how different nucleotide environments could influence the viral polymerase error rate. We were able to identify a minimal nucleotide motif that is favourable to insertion and substitution events that could potentially lead to HPAIV emergence. Moreover, recombination events with both ribosomal RNA and viral segments have been observed in our system. This work permits us to better comprehend the viral genetic elements that influence viral polymerase errors and HPAIV emergence.