Étude Biochimique et Structurale des spécificités fonctionnelles d'une nouvelle famille de toxines bactériennes à activité nucléotidyl cyclase, appelées toxines de type ExoY, activées par l'actine

Biochemical and structural study of the functional specificities of a new family of bacterial nucleotidyl cyclase toxins, called ExoY-like toxins, activated by actin in host cells

• Auteur / Autrice : Magda Teixeira Nunes
• Direction : Louis Renault
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biochimie et biologie structurale
• Date : Soutenance le 12/07/2022
• Etablissement(s) : université Paris-Saclay
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Structure et Dynamique des Systèmes Vivants
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Institut de biologie intégrative de la cellule (Gif-Sur-Yvette, Essonne ; 2015-....)
• Partenaire(s) de recherche : référent : Faculté des sciences d'Orsay
• Partenaire(s) de recherche : graduate school : Université Paris-Saclay. Graduate School Life Sciences and Health (2020-....)
• Jury : Président / Présidente : Guy Tran Van Nhieu
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Olena Pylypenko, Alexandre Chenal, Undine Mechold, Roland Seifert
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Olena Pylypenko, Alexandre Chenal

Mots clés

Mots clés contrôlés

Relation structure-activité

Toxines bactériennes

Interactions hôte-pathogène

Enzymes -- Régulation

Mots clés libres

Relation structure-Fonction

Mécanismes enzymatiques

Biologie structurale

Interactions hôte-Pathogène

Facteurs de virulence bactériens

Structure-Function relationship

Structure-Function relationship

Structural biology

Host-Pathogen interactions

Bacterial virulence factors

Résumé

Résumé :Les toxines nucléotidyl cyclases (NC) bactériennes de type ExoY appartiennent à une sous-famille de NC bactériennes qui sont activées dans les cellules eucaryotes infectées en interagissant avec des cofacteurs eucaryotes spécifiques. Une fois activées, elles convertissent des nucléosides-5' triphosphate en nucléosides 3',5'-monophosphate cycliques (cNMP) et en pyrophosphate. La production de niveaux supraphysiologiques de cNMP perturbe diverses voies de signalisation intracellulaires dépendantes des cNMP. Alors que les membres les plus étudiés de la famille, le facteur d'œdème (EF) de Bacillus anthracis et la toxine CyaA de Bordetella pertussis, sont activés par calmoduline, les toxines ExoY utilisent un cofacteur atypique qui est l'actine. Les spécificités fonctionnelles et de virulence des toxines ExoY restent largement inconnues.L'Exoenzyme Y (Pa-ExoY) a d'abord été identifiée comme une exotoxine sécrétée par le système de sécrétion de type III (T3SS) de Pseudomonas aeruginosa (P. a., Pa), un agent pathogène humain majeur. Divers modules enzymatiques ou protéines effectrices de type ExoY ont été depuis identifiés dans des protéobactéries Gram négatives qui représentent des agents pathogènes humains ou animaux émergents.J'ai caractérisé en particulier le module ExoY (Vn-ExoY) de la toxine MARTX (Multifunctional-Autoprocessing Repeats-in-ToXin) de Vibrio nigripulchritudo, un pathogène marin émergent. Vn-ExoY montre une préférence pour l'ATP comme substrat mais peut également utiliser le CTP. En revanche, Pa-ExoY présente une activité NC différente avec la préférence de substrat suivante in vitro : GTP>ATP≥UTP>CTP. En outre, alors que Pa-ExoY se lient aux filaments d'actine (actine-F) pour une activation maximale, Vn-ExoY est sélectivement activée par l'actine monomérique (actine-G).Les bases structurales de ces spécificités fonctionnelles sont inconnues et ont été étudiées au cours de ma thèse.Au niveau structural les toxines NC bactériennes appartiennent à la classe II des adénylyl cyclases (AC) et ne présentent aucune homologie avec les AC de classe III des mammifères et peuvent donc représenter des cibles thérapeutiques potentielles.Mes travaux visent à comprendre les spécificités fonctionnelles, la relation structure-fonction des toxines ExoY et leurs cytotoxicités dans les cellules hôtes. J'ai caractérisé certaines spécificités fonctionnelles liées à l'utilisation de l'actine-G comme cofacteur en utilisant Vn-ExoY comme modèle.L'étude biochimique de la dynamique de l'auto-assemblage de l'actine montre que Vn-ExoY peut se fixer et être activée par le complexe profiline:actine-G, qui est abondant et essentiel pour la dynamique des extrémités barbées (ou +) des filaments dans les cellules eucaryotes. Ce complexe pourrait donc représenter le cofacteur physiologique des toxines ExoY activées par l'actine-G. Vn-ExoY inhibe in vitro l'association spontanée, ou médiée par des facteurs d'élongation, des complexes profiline:actine avec les extrémités (+) de l'actine-F, ce qui peut contribuer à la cytotoxicité de Vn-ExoY.J'ai aussi obtenu une série de structures cristallines de Vn-ExoY liée à l'ATP-/ADP-actine ou ADP-/ATP-actine-profiline avec divers analogues/dérivés de substrats ou produits. Certaines de ces structures sont en cours d'optimisation. Ces données structurales permettent d'identifier des éléments clés pour la reconnaissance et l'activation des toxines ExoY par l'actine-G ou -F, leurs réactions enzymatiques, leur inhibition, et leurs différentes préférences de substrats. Elles démontrent que les toxines ExoY utilisent un mécanisme catalytique à deux ions métalliques. Elles fournissent différents instantanés des changements conformationnels de Vn-ExoY qui sont induits par l'actine ou le substrat, et qui sont cruciaux pour la stabilisation du substrat et la catalyse dans toutes les toxines NC structurellement apparentées. Ces éléments peuvent représenter des pistes pour inhiber ces toxines.

Abstract :Bacterial ExoY-like nucleotidyl cyclase (NC) toxins belong to a subfamily of bacterial structurally related NCs that are activated in eukaryotic cells by interacting with specific eukaryotic cofactors. Once activated, they convert efficiently various nucleoside-5' triphosphates into nucleoside 3',5'-cyclic monophosphates (cNMPs) and pyrophosphate. By catalyzing unregulated supraphysiologic levels of cNMPs, they can disrupt various intracellular cNMP-dependent signaling pathways. While the most well-studied members of the family, ie the Edema Factor (EF) from Bacillus anthracis and CyaA toxin from Bordetella pertussis, are both activated by calmodulin, ExoY toxins use an atypical cofactor that is actin. The functional and virulence specificities of ExoY NC toxins in diverse bacterial infections remain largely unknown.The Exoenzyme Y (Pa-ExoY) was first identified as one of the two most prevalent exotoxins secreted by the type III secretion system (T3SS) of Pseudomonas aeruginosa (P. a., Pa), a major opportunistic human pathogen. Poorly characterized ExoY-related enzymatic modules or effector proteins have been since identified in various Gram-negative proteobacteria representing emerging human or animal pathogens.I have worked especially on the ExoY module (Vn-ExoY) of the MARTX (Multifunctional-Autoprocessing Repeats-in-ToXin) toxin of Vibrio nigripulchritudo, an emerging marine pathogen. Vn-ExoY displays a strong preference for ATP as substrate but can also use CTP to a lesser extent. In contrast, activated Pa-ExoY exhibits a different and promiscuous NC activity with the following in vitro substrate preference: GTP>ATP≥UTP>CTP. In addition, Pa-ExoY requires actin filaments (F-actin) for maximum activation, while Vn-ExoY is selectively activated by monomeric actin (G-actin).The structural bases for these functional specificities are unknown and have been studied during my PhD.At the structural and enzymatic level, bacterial NC toxins define the class II of monomeric adenylyl cyclases (AC) and they have no structural homology with the widespread class III of mammalian adenylyl or guanylyl cyclases (AC/GC) and may thus represent potential drug targets against bacterial infections.My PhD work aims to better understand the structure-function relationship of ExoY-like NC toxins and their respective cytotoxicity in host cells. During my PhD, I characterized more especially some functional specificities underlying the use of G-actin as cofactor using Vn-ExoY as a model.My biochemical investigations in actin self-assembly dynamics show that Vn-ExoY can conveniently use and be activated by the profilin:G-actin complex, which is abundant and critical for the dynamics of the barbed or (+) ends of actin filaments in eukaryotic cells. This complex is likely to represent the physiological eukaryotic cofactor used by G-actin-selective ExoY-like NC toxins. In addition, Vn-ExoY inhibits in vitro the spontaneous or elongation factor-mediated association of profilin:actin complexes with F-actin barbed ends, which may contribute to Vn-ExoY cytotoxicity independently of its NC activity.I have also obtained a series of high-resolution crystal structures of Vn-ExoY bound to ATP-/ADP-actin or ADP-/ATP-actin-profilin with different nucleotide substrate analogs/derivatives or products. Some are still in process to be optimized. These structural data allow to identify key elements for the recognition and activation of ExoY NC toxins by G- or F-actin, their NC enzymatic reaction, inhibition and different substrate preferences. They conclusively demonstrate that ExoY NC toxins use a two metal-ion mechanism for catalysis. They provide different structural snapshots of the actin- and substrate-metal-induced conformational changes during ExoY activation, which are crucial for proper substrate-stabilization and catalysis in all the structurally-related NC toxins and may represent hints to inhibit these invasive NC.