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Régulation de la commutation motrice sur les RNP oskar

par Ly Jane Phea

Thèse de doctorat en Développement (ED 157)

Sous la direction de Anne Ephrussi.

Thèses en préparation à l'Université Paris Cité , dans le cadre de ED 562 Bio Sorbonne Paris Cité .


  • Résumé

    L'ARN oskar a été classiquement utilisé comme paradigme pour l'étude de la localisation des ARN, car sa localisation au pôle postérieur de l'ovocyte de la drosophile est importante pour la spécification des structures abdominales ainsi que des futures cellules germinales de l'embryon. La localisation correcte de l'ARN oskar nécessite également une coordination spatiale et temporelle précise de deux protéines motrices de polarité opposée, servant ainsi d'étude de cas importante sur les mécanismes de régulation de la directionnalité du transport basé sur les moteurs du cytosquelette. L'ARN oskar est transcrit dans les cellules nourricières et transporté par des canaux annulaires dans l'ovocyte par la dynéine cytoplasmique. Une fois localisé dans l'ovocyte, l'ARN oskar subit une "marche aléatoire biaisée" médiée par la kinésine le long de microtubules dont les extrémités positives ont un léger biais vers le pôle postérieur de l'ovocyte. Des expériences génétiques combinées à l'imagerie in vivo de l'ARN oskar suggèrent que des protéines autres que la kinésine-1 sont impliquées dans la localisation postérieure de l'ARN oskar. Chez les mutants Staufen et Tropomyosine atypique, Tropomyosine1-I/C (aTm1), l'ARN oskar se localise à l'antérieur de l'ovocyte. Les composants du EJC ainsi que le SOLE, une tige-boucle formée lors de l'épissage de l'ARN oskar, se sont également avérés nécessaires au transport de l'ARN oskar médié par la kinésine. Cette accumulation antérieure de l'ARN oskar ressemble à la localisation d'ARNs tels que bicoid et gurken, qui sont transportés dans l'ovocyte par la dynéine, qui reste active sur ces ARN dans l'ovocyte. Cela suggère que la dynéine reste attachée à l'ARN oskar dans l'ovocyte et s'engage dans une lutte avec la kinésine sur l'ARN oskar. Ainsi, pour une localisation correcte de l'ARN oskar au pôle postérieur de l'ovocyte, la voie de la dynéine " par défaut " doit être " désactivée ", afin de permettre un transport médié par la kinésine-1. Dans une série d'expériences menées en collaboration avec Imre Gaspar, nous avons découvert que Staufen antagonise l'activité de la dynéine sur les RNP d'oskar, permettant ainsi de passer à un transport basé sur la kinésine. Il est important, cependant, que Staufen n'interfère pas avec le transport médié par la dynéine de l'ARN oskar, des cellules nourricières vers l'ovocyte. Ceci est régulé en s'assurant que l'accumulation de la protéine Staufen se produit uniquement dans l'ovocyte et non dans les cellules nourricières, un processus qui dépend d'Egalitarian. Nous avons découvert qu'Egalitarian est nécessaire pour l'accumulation de l'ARN de staufen et donc de la protéine Staufen dans l'ovocyte, servant ainsi de mécanisme de régulation assurant que Staufen n'inactive la dynéine qu'une fois que les RNP oskar sont dans l'ovocyte. Il a été démontré que le recrutement de la kinésine-1 a lieu dans les cellules nourricières, par l'intermédiaire de aTm1, qui agit comme une protéine adaptatrice pour relier l'ARN oskar à la kinésine. Pour comprendre le rôle de l'aTm1 dans la transition de la dynéine à la kinésine, nous avons attaché l'aTm1 ou la kinésine-1 à des constructions d'ARN oskar dépourvues de la SOLE, dans le but de récapituler le transport de l'ARN oskar avec l'aTm1 liée de façon stable. Nos résultats suggèrent que l'aTm1 liée de façon stable à l'ARN peut effectivement contourner le SOLE et l'EJC pour médier l'activité de la kinésine-1, cependant les effets de l'aTm1 attachée sont moins puissants que ceux de la kinésine-1 attachée. Nous montrons également que la liaison stable de la kinésine-1 à la cargaison d'ARN est suffisante pour une forte activité de la kinésine-1. L'aTm1 liée de manière stable, quant à elle, ne peut médier qu'une activité de kinésine modérée, suggérant que d'autres facteurs sont peut-être nécessaires pour stabiliser la liaison de la kinésine-1 à la cargaison d'ARN.

  • Titre traduit

    Regulation of motor switching on oskar RNPs


  • Résumé

    Oskar RNA has been classically used as a paradigm for the study of RNA localization, as its localization to the posterior pole of the Drosophila oocyte is important for the specification of abdominal structures as well as the future germline cells in the embryo. The proper localization of oskar RNA requires precise spatial and temporal coordination of two opposing polarity motor proteins, thus serving as an important case study into the mechanisms of regulation of the directionality of cytoskeletal motor-based transport. oskar RNA is transcribed in the nurse cells and transported via ring canals into the oocyte by cytoplasmic dynein (Bullock and Ish-Horowicz, 2001; Jambor et al, 2014). Once localized in the oocyte, oskar RNA undergoes a kinesin-mediated "biased random walk" along microtubules whose plus ends have a slight bias towards the posterior pole of the oocyte (Zimyanin et al, 2008, Brendza et al., 2002, Cha et al., 2002). Genetic experiments combined with in vivo imaging of oskar RNAs suggest that proteins other than kinesin-1 are involved in the posterior localization of oskar RNA (Zimyanin et al, 2008). In Staufen and atypical Tropomyosin, Tropomyosin1-I/C (aTm1) mutants, oskar RNA localizes at the anterior of the oocyte (Kim-Ha et al., 1991; St. Johnston et al., 2001). Components of the EJC as well as the SOLE, a stem loop formed upon splicing of oskar RNA, have also been found to be necessary for kinesin-mediated transport of oskar RNA (Hachet & Ephrussi, 2004; Ghosh et al., 2012). The anterior accumulation of oskar RNA resembles the localization of RNAs such as bicoid and gurken, that are transported into the oocyte by dynein, which remains active on these RNAs in the oocyte (Serano and Cohen, 1995). This suggests that dynein remains attached to oskar RNAs in the oocyte and engages in a tug of war with kinesin on oskar RNAs. Thus, for proper localization of oskar RNA to the posterior of the oocyte, the "default" dynein pathway has to be "switched off", to allow kinesin-1 mediated transport. In a series of experiments conducted in collaboration with Imre Gaspar, we found that Staufen antagonizes the activity of dynein on oskar RNPs, allowing a switch to kinesin-based transport. It is important, however, that Staufen does not interfere with dynein mediated transport of oskar RNA from the nurse cells to the oocyte. This is regulated by ensuring that the accumulation of Staufen protein occurs only in the oocyte, but not in the nurse cells, through a process that is dependent on Egalitarian. We found that Egalitarian is required for the accumulation of staufen RNA and therefore Staufen protein in the oocyte, thus serving as a regulatory mechanism ensuring that Staufen only inactivates dynein once oskar RNPs are in the oocyte. The recruitment of kinesin-1 to oskar RNA was shown to occur in the nurse cells, mediated by aTm1 (Gaspar et al, 2017) which acts as an adaptor protein to link oskar to kinesin. To understand the role of aTm1 in modulating the switch, we tethered aTm1 or kinesin-1 to oskar RNA constructs lacking the SOLE with the aim of recapitulating oskar RNA transport with stably bound aTm1. Our results suggest that stably bound aTm1 can indeed bypass the SOLE and EJC to mediate kinesin-1 activity, but the effects of tethered aTm1 are less potent than that of tethered kinesin-1. We also show that stable binding of kinesin-1 to the RNA cargo is sufficient for strong kinesin-1 activity. Stably bound aTm1,meanwhile, can only mediate mild kinesin activity, suggesting that other factors may be required to stabilize the binding of kinesin-1 to the RNA cargo.