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Développement d'un microréacteur biomimétique pour l'analyse in situ d'activités enzymatiques par couplage de l'électrochimie et de la microscopie de fluorescence

par Pauline Lefrancois

Thèse de doctorat en Chimie Physique

Sous la direction de Stéphane Arbault.

Thèses en préparation à Bordeaux , dans le cadre de École doctorale des sciences chimiques (Talence, Gironde) , en partenariat avec Institut des Sciences Moléculaires (laboratoire) et de NanoSystèmes Analytiques (NSysA) (equipe de recherche) depuis le 01-11-2014 .


  • Résumé

    Le projet de ma thèse s'inscrit dans une approche « bottom-up » dont le but est l'étude des réactions enzymatiques liées aux NO-Synthases dans des compartiments dont la taille est similaire à celle d'une cellule eucaryote, soit allant de 10 à 100 µm. Une cellule est un organisme vivant complexe, ce qui en fait un mauvais modèle expérimental. Il serait impossible d'établir un protocole expérimental ne sondant qu'un seul paramètre d'une cellule puisque chaque élément d'une cellule influe sur un autre. Pour s'affranchir de cet aspect, des modèles cellulaires ont été développés. Dans le cadre de cette thèse, l'activité des NO-Synthases est caractérisée dans des compartiments assimilés à des microréacteurs biomimétiques formés par des vésicules géantes dont la membrane est composée par une bicouche unilamellaire phospholipidique (GUV : giant unilamellar vesicle). Les objectifs de cette thèse sont le développement de microréacteurs biomimétiques, l'encapsulation de l'enzyme NO-Synthase, la modification du milieu interne du microréacteur pour activer l'enzyme par ajout de co-facteurs et substrat et enfin, la caractérisation des activités de l'enzyme par couplage électrochimique, microscopique et spectroscopique.

  • Titre traduit

    Development of a single biomimetic microreactor for enzymatic activities in situ analyzes by coupling electrochemistry and fluorescence microscopy


  • Résumé

    Enzymatic reactions are involved in many physiological phenomena in living organisms. These reactions are based on protons and electrons transfers and can lead to the production of by-products. Among them, reactive oxygen and nitrogen species (ROS and RNS) are of great interest as they play a double role: on the one hand by allowing the organism to react to a stress by the activation of signaling redox pathways, and on the other hand, ROS and RNS can cause oxidative damages to tissues ensuing dysfunctions in the organism. The high reactivity of such species induce their short lifetimes (ns-min) and leads to uncertainties when it comes to the study of some enzymatic reactions in bulk. This PhD project aims to develop a biomimetic microreactor for the study of enzymatic activities producing ROS/RNS. Indeed, by confining a reaction within a cell-sized compartment (20-100 µm diameter), the generated species (H2O2, NO•, NO2-) could be analyzed in situ with a quantitative and kinetic resolution. Giant unilamellar vesicles are formed in physiological conditions and are used as microreactors for the monitoring of enzymatic activities of glucose oxidase and NO-synthases. Fluorescence microscopy allows individual vesicle observation and the monitoring of reactions triggered by microinjection. Then, released species are detected in real-time by electrochemistry in order to decipher the diverse enzymatic pathways of NO-Synthases.