ARN interférence : une stratégie pour cibler la protéine kinase B (Akt) dans le carcinome hépatocellulaire

RNA interference : a strategy for targeting protein kinase B (Akt) in hepatocellular carcinoma

• Auteur / Autrice : Mariam Mroweh
• Direction : Patrice Marche, Bassam Badran
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Virologie microbiologie immunologie
• Date : Soutenance le 31/03/2022
• Etablissement(s) : Université Grenoble Alpes en cotutelle avec Université Libanaise
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale chimie et science du vivant (Grenoble ; 199.-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Institut pour l'avancée des biosciences (Grenoble) - Université Libanaise
• Jury : Président / Présidente : Walid Rachidi
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Patrice Marche, Bassam Badran, Eva Hamade, Nader Hussein, Marc Billaud
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Birke Bartosch, Rabih Talhouk

Mots clés

Mots clés contrôlés

ARN interférence

Protéines kinases

Carcinome hépatocellulaire

Mots clés libres

Carcinome hépatocellulaire

Protéine kinase B

ARN interférence

Hepatocellular carcinoma

Protein kinase B

RNA interference

Résumé

Le carcinome hépatocellulaire (CHC) est l'une des causes les plus courantes de décès liés au cancer dans le monde, et son incidence est en augmentation. Le CHC se développe presque exclusivement sur des antécédents inflammatoires chroniques du foie, qui peuvent être causés par une consommation addictive d’alcool, une hépatite virale ou une mauvaise alimentation. Le CHC présente une dérégulation d'une multitude de voies, y compris la voie PI3K/AKT. La protéine kinase B (Akt) existe sous 3 isoformes : Akt1, Akt2 et Akt3, transcrites à partir de trois gènes différant par leurs niveaux d'expression dans le corps humain. Alors qu'AktT3 est exprimé principalement dans le cerveau et les testicules, Akt1 est exprimé de manière constitutive dans tout le corps et Akt2 est principalement exprimé dans les tissus sensibles à l'insuline. Le ciblage d'Akt par des inhibiteurs chimiques a montré un puissant effet anticancéreux. Cependant, ces composés ne présentent pas de spécificité pour les différents isoformes, qui convergent et divergent dans leurs rôles dans le contrôle de divers processus cellulaires. Ainsi, une inhibition sélective est nécessaire pour attribuer le rôle de chacune des isoformes Akt1 et Akt2, dans le contexte du CHC. L'ARN interférence (ARNi) est une stratégie hautement spécifique pour cibler l'expression d'un gène au niveau transcriptionnel. Il est possible de l’utiliser pour supprimer l'expression d'un gène donné en utilisant des siARN interférents courts et exogènes. Ainsi, nous avons conçu des siARN ciblant uniquement l'isoforme Akt1 ou Akt2 chez l'homme et le rongeur, simultanément. La spécificité des siARN a été vérifiée en confirmant, in-vitro, sur la lignée cellulaire HepG2 humaine, l'inhibition sélective de l'expression Akt1 ou Akt2, en plus de l'absence d'effets « off-target » prédits lors de l'analyse in-silico. De plus, l'efficacité des siARN a été observée dès 6 heures après l'exposition aux siARN Akt1 et Akt2 et est restée jusqu'à 5 et 7 jours dans les cellules HepG2. Les siRNA ont montré une efficacité à de faibles concentrations, à partir de 20pM, à la fois au niveau des ARNm et des protéines. L'effet inflammatoire des siARN a également été évalué et les résultats montrent que les siARN conçus n'activent aucun des récepteurs de type Toll-like (TLR). Ensuite, nous avons évalué l'aspect phénotypique (cytotoxicité, métabolisme et prolifération) de l'inactivation d'Akt1 et d'Akt2 ou de l'inactivation simultanée des deux par les siARN en comparaison avec le Sorafenib (un traitement de référence en cours du CHC) et à l'ARQ092 (un inhibiteur chimique d’Akt) sur 4 lignées cellulaires différentes de cancer du foie : PLCϒ/PRF/5, Huh7, Hep3B et HepG2. Les résultats montrent que le ciblage d'une seule isoforme d'Akt ou l'inactivation simultanée des deux isoformes par les siARN conçus n'a aucun impact sur la viabilité, le métabolisme ou la prolifération des cellules, ce qui est contradictoire avec l'effet observé lors d'un traitement avec les inhibiteurs Sorafenib ou ARQ092. De plus, la vectorisation des siARN par le dendrimère amphiphile (AD) et leur utilisation pour cibler Akt1 ou Akt2 dans un modèle de greffe de lignée cellulaire (HepG2 et MV4-11) in-ovo n'ont montré aucun effet toxique sur les embryons de poulet, ni d’effet antitumoral. Dans l'ensemble, les résultats montrent que l'inactivation d'une seule isoforme d'Akt n'est pas suffisante pour monter un effet antitumoral. De plus, l'inactivation simultanée des deux n'imite pas l'effet observé par les inhibiteurs chimiques d'Akt. Ces résultats suggèrent la présence de mécanismes compensatoires dans le cas de l'inactivation d'une seule isoforme d’Akt, et qu'en plus de la forte inhibition globale d'Akt, ARQ092 pourrait exercer une inhibition pléiotrope conduisant à son importante activité anticancéreuse.

Hepatocellular carcinoma (HCC) is one of the most common causes of cancer-related deaths worldwide, and its incidence is rising. HCC develops almost exclusively on the background of chronic liver inflammation, which can be caused by chronic alcohol consumption, viral hepatitis, or an unhealthy diet. HCC exhibits a deregulation of a multitude of pathways, including the PI3K/Akt pathway. Protein kinase B (Akt) exists in 3 isoforms: Akt1, Akt2 and Akt3, transcribed from three different genes and differing in their expression levels throughout the human body. While Akt3 is expressed mainly in the brain and the testes, Akt1 is expressed constitutively in the body and Akt2 is mainly expressed in insulin-sensitive tissues. Targeting Akt through chemical inhibitors has shown potent anti-cancer effect. However, chemical inhibitors fail to show a specificity over either of the isoforms, which converge and diverge in their designated roles in controlling various cellular processes. Thus, selective inhibition is needed to confer the role of each of Akt1 and Akt2 isoforms, in the context of HCC. RNA-interference (RNAi) is a highly specific strategy to target the expression of a gene at the transcriptional level and can be exploited to suppress the expression of a given gene using exogenous small interfering siRNAs (siRNAs). For that, we designed (siRNAs) targeting solely Akt1 or Akt2 isoform in humans and rodents, simultaneously. The specificity of the siRNAs was verified by confirming, in-vitro on human HepG2 cell line, the selective inhibition of the designated Akt1 or Akt2 expression, in addition to the absence of predicted off-target effects upon in-silico analysis. Furthermore, the efficiency of the designed siRNAs was demonstrated; following 6 hours of exposure to designed Akt1 and Akt2 siRNAs, the Akt1 expression and Akt2 expression remained decreased up to 5 and 7 days in HepG2 cells, respectively, and showed efficacy at low concentrations, starting 20pM. The possible inflammatory effect of the siRNAs was also assessed, and the results show that the designed siRNAs do not activate any of the Toll-like receptors. Next, we assessed the phenotypic aspect (cytotoxicity, metabolism and proliferation) of the knockdown of Akt1 and Akt2 or the simultaneous knockdown of both by the designed siRNAs whilst comparing to Sorafenib (a verified treatment of HCC) and ARQ092 (a chemical inhibitor of Akt) on 4 different liver cancer cell lines -PLCϒ/PRF/5, Huh7, Hep3B and HepG2 cell lines. The results show that targeting a single isoform of Akt – either Akt1 or Akt2 – or the simultaneous knockdown of both isoforms – Akt1 and Akt2 - by the designed siRNAs have no impact on the viability, metabolism or proliferation of the cells that is contradictory to the effect seen upon treatment with inhibitors Sorafenib or ARQ092. Furthermore, the vectorization of the designed siRNAs by the Amphiphilic Dendrimer (AD) and their consequent use to target Akt1 or Akt2 in an in-ovo HepG2 and MV4-11 cell-line graft model showed neither a toxic effect on chick embryos, nor an anti-tumorigenic effect when compared to the control. Altogether, the results show that the knockdown of a single isoform of Akt: Akt1 or Akt2 using the designed siRNAs, is not sufficient to mount an anti-cancer effect. Furthermore, the simultaneous knockdown of both isoforms using the specific siRNAs against Akt1 and Akt2 does not mimic the effect seen by chemical Akt inhibitors. These results suggest the presence of compensatory mechanisms in the case of the targeted single isoform knockdown, and that in addition to the potent global inhibition of Akt, ARQ092 may exert an off-target inhibition leading to its prominent anti-cancer activity.