Programmation moléculaire pour la détection ultrasensible de biomarqueurs impliqués dans les maladies neurodégénératives

Molecular programming for the ultra-sensitive detection of biomarkers involved in neurodegenerative diseases

• Auteur / Autrice : Antoine Masurier
• Direction : Yannick Rondelez
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Interface chimie-biologie
• Date : Soutenance le 07/10/2021
• Etablissement(s) : Université Paris sciences et lettres
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Médicament, toxicologie, chimie, imageries (Paris ; 2014-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : GULLIVER - Gulliver (UMR 7083)
• Partenaire(s) de recherche : établissement opérateur d'inscription : Ecole supérieure de physique et de chimie industrielles de la Ville de Paris (1882-....)
• Jury : Président / Présidente : Nadia Cherradi
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Yannick Rondelez, Nadia Cherradi, Frédéric Ducongé, Didier Gasparutto, Stéphanie Descroix, Alexis Vlandas
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Frédéric Ducongé, Didier Gasparutto

Mots clés

Mots clés libres

Biomarqueur

Diagnostic

Maladie neurodégénérative

Programmation moléculaire

Biomarker

Diagnosis

Neurodegenerative disease

Molecular programming

Résumé

Les récentes avancées en matière de diagnostic moléculaire donnent une idée des avantages qu'il y a à quantifier simultanément plusieurs biomarqueurs pour obtenir un diagnostic robuste d'une maladie. Parmi ces biomarqueurs, nous pouvons distinguer les microARNs (miARNs) et les protéines. Les miARNs sont une classe d'ARN courts (21-25 nucléotides) impliqués dans la régulation post-transcriptionnelle d'environ 60% des gènes humains. De l'autre côté, les protéines résultent de la transcription-traduction des gènes et reflètent ainsi le phénotype cellulaire. Tous deux sont dérégulés dans un certain nombre de maladies, comme les cancers, les maladies neurodégénératives ou les infections, et peuvent servir de biomarqueurs apportant des informations complémentaires. Les outils utilisés pour les mesurer doivent être sensibles, spécifiques et quantitatifs. De plus, la détection des niveaux de traces est un défi en raison de la toxicité et des effets de fond provenant d’échantillons biologiques.Dans cette thèse de doctorat, nous avons développé une méthode de détection sensible applicable à plusieurs classes de biomarqueurs. Nous rapportons le développement d'une plateforme générique, appelée Amplificateur Moléculaire Ultrasensible Programmable (PUMA) pour la détection des miARNs et des protéines.Nous nous sommes concentrés sur la détection de miARNs dérégulés dans la maladie de Parkinson, tel que mir7-5p. Nous avons travaillé sur une étape de capture utilisant des particules fonctionnalisées avec de l’ADN et montré qu'elle permettait d'éliminer la toxicité des matrices biologiques. Une étape de capture par ligation a ensuite été introduite pour tenter d'augmenter la sensibilité et la spécificité de l’approche.Concernant la détection de protéines, une preuve de principe a été obtenue pour la détection de l'alpha-thrombine humaine grâce à des aptamères dans une approche d'extension de proximité. Une méthode immuno-PUMA (inspirée de l'immuno-PCR) a été développée pour la quantification d’interleukines, atteignant des limites de détection dans la gamme du femtomolaire.Notre travail démontre la détection de deux classes importantes de biomarqueurs, les miARNs et les protéines, en raison de la polyvalence de l'approche PUMA . En outre, des résultats préliminaires ont montré la possibilité de détecter des cellules vivantes en combinant l'amplificateur moléculaire avec des aptamères spécifiques aux cellules. Couplé à un dispositif microfluidique, ce test permettra la détection multiplexée et multimodale de différentes classes de biomarqueurs pour l'identification de signatures intégrées de maladies.

Recent molecular diagnosis advances give an idea of what are the benefits of quantifying several biomarkers simultaneously to get a robust diagnostic of a disease. Among those biomarkers, we can distinguish microRNAs (miRNAs) and proteins. MiRNAs are a class of short RNAs (21-25 nucleotides) involved in the post-transcriptional regulation of approximately 60% of human genes. On the other side, proteins result from gene transcription-translation and thus reflect cell phenotype. Both of these are dysregulated in a number of diseases, such as cancers, neurodegenerative and infectious diseases, and can serve as biomarkers, bringing complementary information. The tools used to profile them need to be sensitive, specific and quantitative. Additionally, the detection of trace levels is challenging because of toxicity and background effects arising from the biological samples.In this PhD thesis, we developed a sensitive detection method applicable to multiple classes of biomarkers. We report the development of a generic platform, called Programmable Ultrasensitive Molecular Amplifier (PUMA) that can be used for the detection of both miRNAs and proteins.We focused on the detection of miRNAs dysregulated in Parkinson’s disease, such as mir7-5p. We worked on a capture step using DNA-functionalized particles and showed that it eliminates the toxicity of biological matrices. A ligation-based capture step was also introduced in an attempt to increase the sensitivity and specificity of the approach.Concerning protein biomarkers, a proof of principle was obtained for the detection of human alpha-thrombin thanks to aptamers in a homogeneous proximity extension assay. An immuno-PUMA method (inspired from immuno-PCR) was developed for the quantification of interleukins, reaching limits of detection in the femtomolar range.Our work demonstrates the detection of two important classes of biomarkers, miRNA and protein, owing to the versatility of the PUMA approach. Moreover, preliminary results have shown the possibility to detect live cells combining the molecular amplifier with cell-specific aptamers. Coupled to a microfluidic setup, this assay will allow the multiplexed and multimodal detection of different classes of biomarkers for the identification of integrated disease signatures.