Thèse soutenue

L'oscillateur du cycle cellulaire DnaA et sa coordination avec la croissance et la division cellulaires chez Escherichia coli
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Auteur / Autrice : Ilaria Iuliani
Direction : Bianca Sclavi
Type : Thèse de doctorat
Discipline(s) : Sciences de la vie et de la santé
Date : Soutenance le 21/12/2021
Etablissement(s) : université Paris-Saclay
Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Structure et Dynamique des Systèmes Vivants
Partenaire(s) de recherche : référent : École normale supérieure Paris-Saclay (Gif-sur-Yvette, Essonne ; 1912-....)
graduate school : Université Paris-Saclay. Graduate School Life Sciences and Health (2020-....)
Laboratoire : Laboratoire de biologie et pharmacologie appliquée (Gif-sur-Yvette, Essonne ; 2002-....)
Jury : Président / Présidente : Stéphanie Bury-Moné
Examinateurs / Examinatrices : Philippe Nghe, Ivan Matic, Marco Cosentino Lagomarsino, Gabriele Micali, Petra Levin
Rapporteurs / Rapporteuses : Philippe Nghe, Ivan Matic

Résumé

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Malgré plus de 50 ans d'études, des questions clés sur le cycle cellulaire bactérien restent sans réponse. En particulier, le débat est ouvert concernant la régulation de l'initiation de la réplication de l'ADN chez E. coli et son rôle dans la dynamique de la croissance et de la division cellulaire. Un acteur clé de ces processus est la protéine DnaA, qui est impliquée dans l'initiation de la réplication de l'ADN. On pense généralement que DnaA est un oscillateur du cycle cellulaire et un senseur de taille cellulaire, mais aucun de ces faits n'a été fermement établi.L'activité de DnaA dépend de son état de liaison aux nucléotides, la forme liée à l'ATP étant celle qui est active pour la reconnaissance et l'activation de l'origine. DnaA est également un facteur de transcription, un nœud hautement connecté dans le réseau des gènes codant pour les protéines nécessaires à la réplication de l'ADN. La régulation différentielle de l'expression des gènes par les différentes formes liées aux nucléotides de DnaA, y compris la régulation de son propre promoteur, est considérée comme centrale dans son rôle d'oscillateur et de régulateur du cycle cellulaire. En effet, en raison de son double rôle de facteur de transcription et d'activateur de l'initiation du processus de réplication de l'ADN, la protéine DnaA peut agir comme le lien régulateur entre le timing et le niveau d'expression des gènes et les différentes phases du cycle cellulaire bactérien.Cette thèse aborde le problème de l'identification de l'oscillateur du cycle cellulaire lié à l'activité de DnaA, et de sa mise en relation avec la progression du cycle cellulaire de E. coli, en se concentrant en particulier sur la détection de la taille des cellules, le taux de croissance des cellules individuelles et la division cellulaire.L'un des principaux défis dans ce domaine a été de quantifier les changements dans l'activité DnaA-ATP in vivo en temps réel. Ce problème nécessite une résolution dynamique de cellule unique, afin de relier les niveaux et l'activité DnaA aux transitions clés du cycle cellulaire. Pour résoudre ce problème, j'ai développé un ensemble de rapporteurs d'expression génétique utilisant un gène pour une protéine fluorescente sous le contrôle d'un promoteur qui est régulé par DnaA-ATP.De plus, j'ai conçu un dispositif expérimental couplant microscopie quantitative et microfluidique et un pipeline d'analyse de données dédiés à l'étude de la croissance, de la taille et de l'expression génétique des E. coli dans des conditions environnementales contrôlées.Une analyse minutieuse de ces données de la cellule unique en fonction du cycle cellulaire montre que la croissance de E. coli est biphasique et qu'elle suit l'expression d'un promoteur constitutif ori-proximal.De plus, grâce à l'analyse de différents reporters, j'ai pu quantifier pour la première fois l'effet des éléments régulateurs du promoteur dépendant de DnaA. Plus précisément, j'ai découvert que le taux de production de GFP spécifique du volume à partir du promoteur DnaA est un oscillateur du cycle cellulaire bien défini et que le signal de cet oscillateur peut être lié aux processus clés du cycle cellulaire tels que la réplication de l'ADN et la division cellulaire.Cependant, alors que la vision standard du cycle cellulaire le considère comme le résultat d'un seul oscillateur, nos données me conduisent à suggérer qu'au moins deux oscillateurs couplés sont nécessaires pour décrire les processus qui coordonnent la réplication de l'ADN, la croissance cellulaire et la progression du cycle cellulaire. Mon approche permet également de détecter des liens de causalité entre ces différents processus.Ces résultats combinent l'utilisation de modèles mathématiques et de données dynamiques du cellule unique afin de poser des bases quantitatives plus solides pour une caractérisation des mécanismes déterminant une progression robuste du cycle cellulaire chez les bactéries