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Analyse structurale des antagonistes de l'interféron de pneumovirus

par Claire-marie Caseau

Projet de thèse en Biochimie et biologie structurale

Sous la direction de Christina Sizun.

Thèses en préparation à université Paris-Saclay , dans le cadre de École doctorale Innovation thérapeutique : du fondamental à l'appliqué , en partenariat avec Institut de Chimie des Substances Naturelles (laboratoire) et de Faculté de pharmacie (référent) depuis le 01-10-2017 .


  • Résumé

    Le virus respiratoire syncytial humain (RSV) est le principal agent responsable d'infections graves des voies respiratoires basses chez le nouveau-né. Actuellement il n'existe ni vaccin ni traitement réellement efficace. Le RSV est du genre Pneumovirus, famille des Pneumoviridae, ordre des Mononegavirales. Il induit une réponse immunitaire remarquablement faible en comparaison avec d'autres virus apparentés. En effet il a évolué vers une stratégie très spécifique d'évasion des mécanismes de défense immunitaire de l'hôte : il code pour deux protéines dites non structurales, NS1 et NS2. RSV NS1 et NS2 sont hautement conservées à travers les espèces (humain, bovin and ovin), mais n'ont pas d'homologues en-dehors des pneumovirus. Il a été montré que hRSV NS1 et NS2 étaient entre autres des antagonistes des interférons de type I et III. Elles sont toutes deux considérées comme des cibles potentielles pour la prévention et le traitement du RSV. Mais si l'on connaît leurs fonctions, leurs mécanismes d'action ne sont pas bien connus et n'y a que peu de bases structurales pour les étayer. Une seule structure cristallographique de NS1 a été publiée et aucune information structurale n'est disponible pour NS2. En revanche il a été suggéré que ces protéines pouvaient s'associer entre elles pour former des oligomères de taille plus importante qui pourraient être à l'origine d'un dégradosome viral. L'objectif de ma thèse est de caractériser d'un point de vue structural les différents états d'oligomerisation de la protéine NS1 ainsi que les transitions de l'un à l'autre afin de mieux comprendre leur implication dans la pathologie. Pour cela je produis NS1 sous forme isolée et purifiée et je combine des techniques biophysiques de basse résolution telle que la diffusion dynamique de la lumière et des techniques de haute résolution telle que la résonance magnétique nucléaire (RMN) en solution ou à l'état solide ou encore dans des conditions de haute pression. Leptosphaeria maculans est un pathogène de Brassica napus, le colza. Pour l'instant aucun fongicide n'existe pour lutter contre ce champignon, mais des phénotypes de résistance sont apparus au sein du colza. Ce phénomène de résistance est le produit d'une reconnaissance par la plante des protéines dites « effecteurs » du colza, suivi par une réponse immunitaire adaptée. Mais si l'on observe donc une course entre plante et pathogène pour produire et/ou reconnaitre des nouveaux effecteurs, on ne comprend encore très peu les fonctions et structures de ces effecteurs fongiques, qui ne présentent pas ou très peu d'homologie entre eux. Mon projet de thèse se porte sur la caractérisation structurale de la protéine AvrLm1, le premier effecteur de L.maculans contre B.napus. Cette protéine ne cristallise pas à l'inverse de certains autres membres de sa famille, qui eux semblerait présenter une certaine homologie de structure. Je cherche à déterminer la structure par résonance magnétique nucléaire en travaillant avec deux formes de AvrLm1 : une forme entière qui comporte un long bras flexible, ainsi qu'une forme tronquée, avec une partie de ce bras flexible en moins.

  • Titre traduit

    Structural analysis of pneumovirus interferon antagonists


  • Résumé

    Respiratory syncytial virus (RSV) is the main agent responsible for acute lower respiratory tract infections in infants, immunosuppressed and elderly worldwide. There is currently no vaccine and no efficient treatment available. RSV is a member of the genus Pneumovirus, from the Pneumoviridae family, and Mononegavirales order. RSV elicits a remarkably weak innate immune response, as compared to related viruses, and has evolved a unique strategy to evade host defense mechanisms: it encodes two nonstructural (NS) proteins, NS1 and NS2. These proteins are highly conserved amongst species (human, bovine, ovine), but have no homologs outside of the pneumovirus genus. hRSV NS1 and NS2 have been shown to act as antagonists of type I and III interferons (IFN). They are therefore both considered to be effective targets for prevention and treatment of RSV. However, while their function is well studied, their mechanisms of action are relatively unknown, with little structural basis to support them. A single crystal structure of NS1 has been published, and no structural information is available for NS2. Meanwhile studies have shown that these monomeric proteins can assemble to form larger oligomers which create a viral degradosome. My thesis aims to characterize the different states of oligomerisation of both NS proteins in order to better understand their implication in disease. To do this, I produce, purify and isolate NS1 and make use of both low resolution biophysical techniques such as Dynamic Light Scattering and high resolution biophysical techniques such as solution, solid-state and high-pressure Nuclear Magnetic Resonance. Leptosphaeria maculans is a fungal pathogen of Brassica napus, known as rapeseed or oilseed rape. At this point, no commercially available fungicide has proven effective against this fungus, but resistance phenotypes have appeared within the plant. This resistance phenomenon is the product of recognition by the plant of the pathogen's “effector” proteins, followed by an appropriate immune response. Yet while the race between plant and pathogen to produce and/or recognize new effectors is clearly observed, we do not understand much regarding the functions and structures of these fungal effector proteins, many of which present little to no homology to each other. Part of my thesis aims to structurally characterize L.maculans' AvrLm1 protein, its first effector against B.napus. This protein does not crystallize, unlike other members of its family which may be structural homologs of each other. My work makes use of nuclear magnetic resonance to determine AvrLm1's structure via the use of two forms of AvrLm1: the whole protein, which possesses a long flexible arm; and a truncated form, in which part of this flexible arm was removed.