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Identification et caractérisation de nouveaux mécanismes moléculaires et cellulaires impliqués dans les podocytopathies héréditaires.

par Francesco Miscia

Thèse de doctorat en Biologie cellulaire et moleculaire

Sous la direction de Geraldine Mollet.

Thèses en préparation à l'Université Paris Cité , dans le cadre de ED 562 Bio Sorbonne Paris Cité .


  • Résumé

    Les podocytopathies héréditaires sont des maladies rénales rares caractérisées par une perte de protéines dans les urines due à des défauts intrinsèques du podocyte, une cellule épithéliale post-mitotique spécialisée. L'atteinte rénale peut être isolée ou associée à des atteintes extra-rénales comme dans le syndrome de Galloway-Mowat (GAMOS), associant un syndrome néphrotique cortico-résistant (SNCR) à une microcéphalie et une atteinte neurologique. L'identification de mutations dans ces gènes soulève la question fascinante des voies moléculaires qui pourraient être communes au développement et à la fonction rénale et cérébrale, les podocytes et les neurones partageant de nombreuses caractéristiques. L'objectif global de ce travail de thèse était d'identifier de nouveaux gènes candidats de SNCR et GAMOS. Ainsi, cette étude rapporte l'identification de 2 nouvelles mutations du gène TSEN54 (tRNA splicing endonuclease subunit54) chez des patients avec SNCR ou GAMOS. La 1ère mutation crée un site cryptique d'épissage dans l'intron 5 et la 2nd est une mutation non-sens dans l'exon 8. Curieusement, la mutation intronique est présente à l'état homozygote chez les patients avec SNCR, alors qu'elle est à l'état hétérozygote associée en trans à la mutation stop chez le patient avec GAMOS. TSEN54 est une des sous-unités du complexe TSEN, impliqué avec CLP1 dans l'épissage des introns de certains ARNt. Fait intéressant, des mutations ont été identifiées dans les gènes codant toutes les sous-unités du complexe TSEN et CLP1, chez des individus avec hypoplasie pontocérébelleuse (PCH), un groupe de maladies neurodéveloppementales autosomiques récessives rares. Etonnamment, aucune atteinte rénale n'a été rapportée à ce jour dans les cas de PCH. Ainsi, l'objectif de ces travaux a été de chercher à comprendre pourquoi cette mutation particulière du gène TSEN54, et seulement celle-ci, provoque le phénotype rénal isolé. Nous avons d'abord étudié l'impact des mutations sur l'ARNm et les protéines dans des lignées lymphoblastoïdes (LCLs), issues d'un patient avec SNCR et des parents d'un patient avec GAMOS décédé prématurément, et montré que chez le patient avec SNCR deux transcrits sont présents, le 1er correspondant au transcrit sauvage (WT) et le 2nd au transcrit mutant contenant une rétention de 47 paires de bases introniques, confirmant que les deux sites d'épissage canonique et cryptique sont utilisés. De plus, une petite quantité de protéine TSEN54 WT est détectée dans les LCLs du patient avec SNCR, alors qu'aucune protéines mutantes ne l'est. Comme la fonction principale du complexe TSEN est d'épisser les introns, nous avons montré, par séquençage des ARNt (tRNA-seq) des LCLs d'un contrôle et du patient SNCR, une augmentation des ARNt non épissés chez le patient SNCR. De plus, pour mieux comprendre les mécanismes cellulaires responsables de l'atteinte rénale, nous avons montré une diminution de la prolifération et de la synthèse protéique dans les podocytes humains immortalisés exprimant peu de TSEN54. Enfin, pour tenter de comprendre pourquoi les mutations TSEN54 entraînent un phénotype rénal et/ou neurologique, nous avons généré des lignées iPSC à partir du patient avec SNCR et du père du patient GAMOS, cette dernière lignée ayant été génétiquement modifiée par CRISPR/Cas9 pour mimer le génotype du patient GAMOS. Puis, pour obtenir les types cellulaires pertinents pour la maladie, ces lignées iPSC ont été différenciées en cellules souches neurales (NSCs), en neurones corticaux et organoïdes rénaux. À ce jour, plusieurs expériences sont en cours, notamment des analyses des profils transcriptomiques des NSCs et des podocytes triés à partir d'organoïdes rénaux, des analyses des défauts d'épissage des introns et l'étude de divers processus cellulaires dans les NSC. Au total, ces résultats aideront à mieux appréhender les mécanismes cellulaires et moléculaires pathologiques liés aux mutations du gène TSEN54 et responsables du SNCR et du GAMOS.

  • Titre traduit

    Identification and characterization of new molecular and cellular mechanisms involved in hereditary podocytopathies.


  • Résumé

    Hereditary podocytopathies (HP) are rare renal disorders characterized by urinary protein loss and - in case of massive loss - nephrotic syndrome (NS), including steroid-resistant nephrotic syndromes (SRNS), and are due to intrinsic defects of the podocyte, a highly specialized post-mitotic epithelial cell. The renal disease can be isolated or associated with extra-renal manifestations, the most frequent being neurological such as in Galloway-Mowat syndrome (GAMOS), associating SRNS with microcephaly and neurological impairment. The identification of mutations in these genes raises the fascinating question of molecular pathways that could be common to both kidney and brain development and function, in line with growing evidence that podocytes and neurons share a large number of features. The global aim of this PhD thesis was to identify and characterize new candidate genes for SRNS and GAMOS. Thus, this study first reports the identification by exome sequencing of two novel mutations in the TSEN54 gene (tRNA splicing endonuclease subunit 54) in patients with either isolated SRNS or GAMOS. The first mutation creates a cryptic splicing site in intron 5 and the second mutation is a nonsense mutation in exon 8. Intriguingly, this intronic mutation is present in the homozygous state in patients with SRNS, whereas it is associated in trans with the nonsense mutation in a patient with GAMOS. TSEN54 is one of the four subunits of the TSEN complex, known to be involved in the splicing of intron-containing tRNAs, together with CLP1. Interestingly, mutations have been identified in genes encoding all TSEN complex subunits and CLP1, in individuals with pontocerebellar hypoplasia (PCH), a group of rare autosomal recessive neurodevelopmental disorders. Strikingly, no renal involvement has been reported to date in PCH cases. Thus, this study sought to understand why this particular TSEN54 mutation, and only this one, causes the isolated renal phenotype by modelling TSEN54-linked SRNS and -GAMOS using various cellular models to identify the molecular and cellular mechanisms altered in each condition. We first investigated the impact of mutations on mRNA and protein levels in lymphoblastoid cell lines (LCLs) obtained from a SRNS patient with the homozygous intronic mutation and the parents of a GAMOS patient who had died prematurely. We demonstrated that, in the SRNS patient, two transcripts are present, one corresponding to the wild-type (WT) and the other to the mutant transcript containing a 47 intronic base-pair retention, confirming that both the canonical and the cryptic splicing sites are used. In addition, a small amount of TSEN54-WT protein was detected in SRNS patient LCLs, whereas both mutant proteins were not. As the main function of TSEN complex is to remove introns in tRNAs, we performed tRNA-sequencing on LCLs from a control and the SRNS patient. Preliminary data suggested an increase in unspliced tRNAs in the SRNS patient. In addition, to better understand the cellular mechanisms underlying the renal defect, we knocked-down (KD) TSEN54 using shRNA in human podocyte lines and showed that KD podocytes exhibit reduced proliferation and protein synthesis. Finally, to obtain the disease relevant cell types, we further derived iPSCs from the SRNS patient and the father of the GAMOS child, this latter iPSC having then been gene-edited by CRISPR/Cas9 to mimic the genotype of the deceased GAMOS patient. Subsequently, these iPSC lines were differentiated towards neural stem cells (NSCs), late cortical neurons and kidney organoids. To date, several experiments are in progress, including analyzes of the transcriptomic profiles of NSCs and podocytes isolated from renal organoids, analysis of intron splicing defects and of various cellular processes on NSCs. Altogether, these results will help deciphering the pathological cellular and molecular mechanisms linked to mutations in TSEN54 and underlying SRNS and GAMOS.