Contribution à l'étude de l'hétérogénéité des cellules stromales / souches mésenchymateuses, focus sur les marqueurs de surface et la sénescence

Contribution to the study of mesenchymal stromal / stem cells heterogeneity, focus on surface markers and senescence

• Auteur / Autrice : Laurie Targa
• Direction : Natalia de Isla
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Sciences de la vie et de la santé
• Date : Soutenance le 12/12/2019
• Etablissement(s) : Université de Lorraine
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale BioSE - Biologie, Santé, Environnement
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Ingénierie moléculaire et physiopathologie articulaire (Vandœuvre-lès-Nancy)
• Jury : Président / Présidente : Marie-Thérèse Rubio
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Natalia de Isla, Georges Uzan, Sven Eyckerman
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Georges Uzan, Sven Eyckerman

Mots clés

Mots clés contrôlés

Interfaces (biologie)

Vieillissement

Cellules

Cytométrie de flux

Marqueurs biologiques

Cellules stromales mésenchymateuses

Mots clés libres

Cellules stromales / souches mésenchymateuses

Hétérogénéité

Marqueurs de surface

Cytométrie en flux

Sous-types de cellules

Sénescence

Mesenchymal stromal / stem cells

Heterogeneity

Surface markers

Flow cytometry

Cell subtypes

Senescence

Résumé

Les Cellules Stromales / Souches Mésenchymateuses (CSM) ont un grand potentiel pour de nombreuses applications. Elles sont les cellules les plus utilisées pour les essais cliniques développant des thérapies cellulaires. L’efficacité thérapeutique des CSM est influencée par leur amplification in vitro et d’autres facteurs tels que les paramètres liés au donneur de cellules. Pour améliorer les thérapies à base de CSM, cette étude a ciblé l’étude de leur hétérogénéité grâce à leurs marqueurs de surface, qui permettent de mutualiser la caractérisation des cellules et la possibilité de trier des cellules vivantes. Le premier objectif de ce travail a été de décrire la variabilité des CSM entre et au sein d’échantillons venant de moelle osseuse de donneurs d’âges différents. Le deuxième objectif a été de développer une méthode de tri pour séparer les CSM selon leur expression de CD146 et de comparer les cellules triées. La troisième partie du travail a eu pour objectif de mieux connaître les marqueurs de surface des CSM sénescentes. Les résultats de cytométrie en flux sur les CSM sont soumis à de fortes fluctuations, mais certaines régularités ont pu être mises en évidence. Un ensemble de marqueurs de surface a pu être associé avec l’âge des donneurs : CD146, CD71, CD105, CD44. De plus, des liens entre l’expression de CD146, CD140b et CD71 ont été observés avec la capacité de prolifération des CSM. Des CSM de moelle osseuse provenant de donneurs d’âges différents et à différentes étapes de culture ont pu être triées avec succès selon leur expression de CD146 par une méthode immunomagnétique. Le comportement des CSM triées était encore hétérogène mais il a pu être observé que les CSM exprimant plus fortement CD146 avaient plus souvent de meilleures capacités de différentiation et de migration et étaient moins sénescentes que les cellules exprimant plus faiblement CD146. Une étude protéomique a montré que la plupart des protéines de surface détectées avaient tendance à être moins représentées sur les cellules sénescentes à l’exception de CD157. Les CSM à différentes étapes de culture jusqu’à la sénescence réplicative ont ensuite été suivies par cytométrie en flux. Cette dernière étude a révélé d’importantes fluctuations entre les différents passages, soulignant la difficulté associée à l’utilisation de ces marqueurs. Les marqueurs CD146, CD71, CD140b et CD157 méritent d’être suivis pour le contrôle qualité des CSM provenant de moelle osseuse.

Mesenchymal Stromal / Stem Cells (MSC) hold great potential and are currently the most used in clinical trials with cell-based treatments. MSC quality and therapeutic effectiveness are influenced by in vitro expansion but also by other factors such as donor parameters. To ameliorate the success rate of MSC therapies, this study focused on MSC heterogeneity. To put together cell characterization and ways to act when facing cell heterogeneity, this work was oriented toward the study of surface markers that can be monitored on living cells, and can serve to sort them. The first objective was to describe initial MSC surface markers variability between and within different bone marrow MSC samples from donors of different ages. The second objective was to develop a sorting method to separate MSC according to CD146 expression and compare the sorted cells. The third objective was to widen MSC surface markers knowledge by focusing on senescent MSC. Surface markers of early passage and replicative senescent cells were compared with proteomics and flow cytometry. Flow cytometry results on MSC were shown to be submitted to strong fluctuations. However, some regularities were strong enough to stand out. A group of surface markers were found to be associated with donor age: CD146, CD71, CD105, CD44. CD146, CD140b and CD71 were also correlated with proliferation rate. CD146 expression had the particularity to be relatively stable in culture and turned out to be the most heterogeneously expressed when looking at cell population within the samples. Cultivated MSC from bone marrow coming from donor of different ages and at different culture steps were sorted successfully according to CD146 expression with immunomagnetic method. MSC behavior remained heterogeneous after sort but it could still be observed that most CD146high cells had more often better differentiation and migration capacities and were less senescent than their CD146low counterpart. Proteomics study showed that almost all surface proteins expression tended to decrease on replicative senescent MSC, except one marker that increased: CD157. MSC at different stages of culture until replicative senescence were then studied by flow cytometry. This study revealed strong fluctuation in marker expression between different passages, highlighting again the variability of MSC behavior and the difficulty to predict it. CD146, CD71, CD140b, CD157 and SSC deserve to be followed for MSC quality control.