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Impact du microbiote dans un modèle murin d'allergie aux protéines de lait de vache; apport des Bifidobacterium recombinants producteurs d'IL10

par Aurelie Mauras

Thèse de doctorat en Microbiologie

Sous la direction de Anne-judith Waligora.

Thèses en préparation à Sorbonne Paris Cité , dans le cadre de École doctorale Médicament, toxicologie, chimie, imageries .


  • Résumé

    Les allergies alimentaires sont un problème de santé publique avec un impact significatif sur la qualité de vie et une morbidité élevée. L'allergie aux protéines de lait de vache (APL) est l'allergie la plus fréquente dans la petite enfance, touchant environ 5% des jeunes enfants. Des études cliniques et expérimentales mettent en évidence un lien entre le microbiote intestinal et le développement de ces allergies sans montrer si ces altérations du microbiote sont une cause ou une conséquence de l'allergie. Ces modifications du microbiote constituent un rationnel pour l'utilisation des probiotiques. Dans ce cadre, l'utilisation de probiotiques comme vecteurs vivants pour délivrer des cytokines biologiquement actives en combinant les propriétés bénéfiques intrinsèques de certaines souches et l'effet potentiel de la protéine délivrée est particulièrement intéressant. Le premier objectif de cette thèse a été de comparer l'impact de microbiotes issus d'un enfant allergique aux protéines de lait de vache et d'un enfant sain sur le développement de l'allergie dans un modèle murin gnotobiotique d'allergie aux protéines de lait de vache. La caractérisation des selles de nourrissons sains et allergiques appariés sur l'âge et sur la voie d'accouchement nous a permis de sélectionner un échantillon représentatif de chaque groupe, à savoir avec un moindre niveau de Bifidobacterium spp. et un niveau accrus du groupe Eubacterium rectale/Clostridium coccoides dans les selles de nourrissons allergiques. Les souris gnotobiotiques colonisées par ces deux microbiotes ont été sensibilisées une fois par semaine pendant 5 semaines avec des protéines de lactosérum et de la toxine cholérique, puis challengées par de la bêta-lactoglobuline. Nos analyses ont montré que le microbiote intestinal associé à l'APL influence la réponse clinique et oriente le système immunitaire vers un terrain atopique avec une augmentation des IgE totaux et du ratio IgG1/IgG2a. En revanche les marqueurs associés à une allergie IgE dépendante, immunoglobulines spécifiques de l'allergène et mMCP1, ne sont pas modifiés, suggérant un mécanisme non IgE médié. Le second objectif de cette thèse a été de construire des Bifidobacterium recombinants capable de produire de l'IL-10. Le système BEST pour Bifidobacterium Expression SysTem est basé sur le plasmide pWV01 (capable de se répliquer chez les bactéries Gram-positives et Gram-négatives), un promoteur inductible par le stress et deux peptides signal (SP) différents: SPExp4 issu de Lactococcus lactis et SPBL1181 issu de Bifidobacterium longum. La fonctionnalité du système BEST a été validée dans une souche de Bifidobacterium bifidum in vitro en étudiant la production et la sécrétion d'IL-10 puis in vivo dans un modèle murin d'inflammation de bas grade. La souche de B. bifidum hébergeant le plasmide pBESTBL1181: IL-10 sécrète efficacement l'IL-10, 7 fois plus que son homologue B. bifidum hébergeant le plasmide pBESTExp4: IL-10 et présente des propriétés anti-inflammatoires in vivo. Nous avons par la suite testé cette souche de B. bifidum recombinante dans notre modèle d'allergie au lait de vache sans voir d'effets protecteurs. Le système BEST étant validé, la souche probiotique et la/les protéines immuno-modulatrices bénéfiques dans la prévention de l'allergie restent à définir. Ce travail confirme l'importance du microbiote dans le développement de l'allergie et ouvre de nouvelles perspectives dans sa prise en charge via les probiotiques recombinants.

  • Titre traduit

    Impact of the microbiota in a mouse model of allergy to cow's milk protein; contribution of recombinant Bifidobacterium producing IL-10


  • Résumé

    Food allergies are a significant health burden with a major impact on quality of life and a high morbidity. Cow's milk allergy (CMA) is the most common allergy in early childhood, affecting up to 5% of infants. Clinical and experimental studies reveal a link between the intestinal microbiota and the development of these allergies without showing whether alterations of the microbiota are a cause or a consequence of food allergy. These microbiota modifications constitute a rational for the use of probiotics. In this context, using probiotics as live vectors for delivering biologically active cytokines by combining the intrinsic beneficial properties of some strains and the potential effect of the delivered protein is particularly relevant. The first objective of my PhD was to compare the impact of microbiota from a CMA child and a healthy child on the development of allergy in a gnotobiotic mouse model cow's milk allergy. Stool characterization of healthy and allergic infants matched for age, sex and birth mode, allowed us to select a representative sample from each group, ie, with a lower level of Bifidobacterium spp. and an increased level of the rectal Eubacterium / Clostridium coccoides group in the stools of CMA infants. The gnotobiotic mice colonized by these two microbiota were sensitized once a week for 5 weeks with whey proteins and cholera toxin, then challenged with beta-lactoglobulin. Our analyzes have shown that the intestinal microbiota associated with CMA influences the clinical response and leads the immune system to an atopic orientation with an increase in total IgE and IgG1 / IgG2a ratio. In contrast, markers associated with IgE-dependent allergies, allergen-specific immunoglobulins and mMCP1, are unmodified, suggesting a mediated non-IgE mechanism. The second objective of my PhD was to build recombinant Bifidobacterium producing IL-10. The BEST system, for Bifidobacterium Expression SysTem is based on the broad host range plasmid pWV01, a stress-inducible promoter and two different signal peptides (SP): SPExp4 from Lactococcus lactis and SPBL1181 from Bifidobacterium longum. The functionality of the BEST system was validated in a Bifidobacterium bifidum strain, in vitro by studying the production and secretion of IL-10, and then in vivo in a murine model of low grade inflammation. The B. bifidum strain harboring plasmid pBESTBL1181: IL-10 effectively secretes IL-10, 7-fold higher than its counterpart B. bifidum harboring plasmid pBESTExp4: IL-10 and has anti-inflammatory properties in vivo. We subsequently tested this recombinant B. bifidum strain in our cow's milk allergy model without seeing protective effects. The BEST system being validated, the probiotic strain and immunomodulatory proteins beneficial for allergy prevention remain to be defined. This work assesses the importance of the microbiota in the development of allergy and opens up new perspectives in its management via recombinant probiotics.