SIGNALER une erreur

Etude structurale de la formation du complexe entre Vpr, protéine du VIH et sa cible cellulaire l'UNG2

par Hesna Kara

Thèse de doctorat en Biologie structurale

Sous la direction de Serge Bouaziz.

Thèses en préparation à Sorbonne Paris Cité , dans le cadre de École doctorale Médicament, Toxicologie, Chimie, Imageries .


  • Résumé

    Durant sa multiplication, le VIH-1 a besoin de protéines régulatrices dont dépendent différentes étapes de son cycle de réplication. L'intégration de l'ADN viral dans le génome de la cellule hôte, l'activation de la transcription du LTR (long terminal repeat) et l'arrêt du cycle cellulaire en phase G2 de la cellule sont des étapes indispensables à la multiplication virale sous le contrôle de la protéine de régulation virale Vpr. La protection de l'intégrité du génome viral est contrôlée par l'Uracile DNA glycosylase (UNG2), protéine cellulaire. D'une part, cette protéine humaine répare les mutations induites qui permettent au virus d'échapper au système de défense immunitaire, c'est donc un facteur de restriction de la réplication du VIH. Mais d'autre part, le virus l'emporte avec lui et l'utilise aux premiers stades de son cycle réplicatifs. Ce rôle multiple d'UNG2 rend son interaction avec la protéine Vpr du VIH, qui n'a pas d'équivalent chez l'homme, une cible potentielle contre le VIH. Il a été démontré que le motif WXXF dans l'hélice proche du domaine C-terminal de l'UNG2 et le tryptophane 54 de l'hélice 3 de Vpr sont essentiels à l'interaction. Des résultats de cristallographie ont démontré que Vpr interagissait avec UNG2 à l'aide d'une poche formée entre ces hélices 1 et 2 de celle-ci, au niveau du siège de l'interaction d'UNG2 avec l'ADN et au niveau d'une Leucine 272 d'UNG2. Dans ce travail, nous avons mis au point un protocole d'expression et de purification de l'Uracile DNA Glycosilase-2 humaine (hUNG2). Nous avons également optimisé un protocole d'expression de la protéine virale Vpr en présence de DPC. Nous avons mené l'étude structurale de l¿interaction entre Vpr et UNG2 en commençant par le fragment UNG (218-238), contenant le motif WXXF, en interaction avec le domaine C-terminal de Vpr (52-96) contenant le tryptophane 54. L'interaction a été démontrée in vitro. L'attribution des résonances 13C et 15N du squelette de la protéine humaine UNG2 a été réalisée. L'interaction de l'UNG2 avec la protéine Vpr a ensuite été entreprise afin d'identifier les acides aminés à l'interface par perturbation des déplacements chimiques de l'UNG2. Un premier modèle comportant les acides aminés concernés dont les résonances nucléaires sont perturbés par l'interaction, comprenant la leucine 272, a été fait dans l'acétate en présence de DPC. Une fois le complexe reconstruit, il sera intéressant d'effectuer des tests structuraux et fonctionnels d'inhibition de l'interaction entre ces deux protéines. Des molécules ont été isolées contre Vpr par criblage sur puces à petites molécules et les plus efficaces et plus affines seront optimisées afin de concevoir de nouveaux perturbateurs de la réplication virale.

  • Titre traduit

    Structural study of the interaction between the HIV protein Vpr and its cellular target UNG2


  • Résumé

    During its multiplication, HIV-1 needs regulatory proteins on which depend different stages of its replication cycle . The integration of viral DNA into the genome of the host cell, the activation of long terminal repeat (LTR), transcription and cell cycle arrest in the G2 phase of the cell are essential steps for viral multiplication, under the control of the viral regulatory protein Vpr. The protection of the integrity of the viral genome is controlled by Uracil DNA glycosylase (UNG2), a cellular protein. On the one hand, this human protein repairs the induced mutations that allow the virus to escape the immune system, making it a limiting factor for HIV replication. But on the other hand, the virus uses it in the early stages of its replicative cycle. This multiple role of UNG2 makes its interaction with the HIV Vpr protein, which has no equivalent in humans, a potential target against HIV. It has been shown that the WXXF motif in the helix close to the C-terminal domain of UNG2 and the tryptophan 54 of Vpr's helix 3 are essential for the interaction. Crystallographic results demonstrated that Vpr interacted with UNG2 using a pocket formed between these helices 1 and 2 thereof, at the site of the UNG2 interaction with DNA and at the Leucine 272 of UNG2. In this work, we have developed a protocol for the expression and purification of human Uracil DNA Glycosilase-2 (hUNG2). We also optimized an expression protocol for the viral Vpr protein in the presence of DPC. We conducted the structural study of the interaction between Vpr and UNG2, starting with the fragment UNG (218-238), containing the motif WXXF, interacting with the C-terminal domain of Vpr (52-96) containing tryptophan 54. The interaction has been demonstrated in vitro. The assignment of 13C and 15N resonances of the human protein backbone UNG2 was performed. The interaction of UNG2 with the Vpr protein was then undertaken to identify the amino acids at the interface by disrupting the chemical shifts of UNG2. A first model comprising the relevant amino acids whose nuclear resonances are disturbed by the interaction, including leucine 272, was made in acetate in the presence of DPC. Once the complex is rebuilt, it will be interesting to carry out structural and functional tests to inhibit the interaction between these two proteins. Molecules have been isolated against Vpr by small molecule microarray screening and the most efficient and refined ones will be optimized to design new viral replication disruptors.