Thèse soutenue

Découverte de nouvelles molécules antibiotiques et caractérisation de leurs modes d'action
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Auteur / Autrice : Cécile Jacry
Direction : Matthieu JulesAnne-Gaëlle Planson
Type : Thèse de doctorat
Discipline(s) : Sciences de la vie et de la santé
Date : Soutenance le 04/02/2021
Etablissement(s) : université Paris-Saclay
Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Structure et Dynamique des Systèmes Vivants
Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Microbiologie de l'Alimentation au Service de la Santé humaine (Jouy-en-Josas)
référent : Faculté des sciences d'Orsay
Jury : Président / Présidente : Stéphanie Bury-Moné
Examinateurs / Examinatrices : Harald Putzer, Fabien Letisse, Louis Coroller, Gilles Truan
Rapporteurs / Rapporteuses : Harald Putzer, Fabien Letisse

Résumé

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Les flavonoïdes sont des métabolites secondaires largement répandus chez les plantes et appartiennent à une grande famille de composés chimiques d'intérêt industriel. Les flavonoïdes sont une source importante de nouveaux médicaments et nutraceutiques en raison de leurs activités anti-oxydantes, antivirales, antimicrobiennes, anticancéreuses, etc. Notre étude se concentre sur la caractérisation de l'activité antibactérienne des flavonoïdes ciblant spécifiquement les bactéries à Gram positif. Les objectifs de mon travail de recherche sont i) de mettre en place des méthodologies de cribles efficaces et rapides afin d’évaluer l’activité antibactérienne des flavonoïdes et ii) de déterminer les mécanismes d'action antibactérien des flavonoïdes. La caractérisation de l'activité antibactérienne des flavonoïdes a été réalisée avec des tests de toxicité des flavonoïdes envers la bactérie modèle à Gram positif B. subtilis par la méthode du Live Cell Array permettant d'enregistrer la cinétique de croissance bactérienne en temps réel. Différentes stratégies ont été employées pour décrypter le(s) mode(s) d'action des flavonoïdes ; telles que le crible d'une banque de flavonoïdes pour l'identification de nouveaux composés actifs contre B. subtilis, le crible d'une collection de mutants de B. subtilis pour l'identification de gènes impliqués dans la réponse de B. subtilis aux flavonoïdes, une évolution dirigée en laboratoire de B. subtilis en présence de flavonoïde pour l'obtention et la caractérisation de souches résistantes aux flavonoïdes, et enfin une analyse de la réponse transcriptionnelle de B. subtilis en présence de flavonoïdes. Deux flavonoïdes déjà identifiés dans la littérature pour inhiber la croissance de bactéries à Gram positif, la pinocembrine et la naringénine, ont une activité antibactérienne contre B. subtilis. Une diminution de 50 % du taux de croissance a été observée en présence de 93 mg.L ⁻¹ ou 32 mg.L ⁻¹ de naringénine ou pinocembrine respectivement.Pour décrypter les mécanismes d'action des flavonoïdes, une collection de 63 flavonoïdes a été criblée et les concentrations minimales inhibitrices (MICs) déterminées pour chaque flavonoïde en présence de B. subtilis. 17 flavonoïdes se sont avérés particulièrement actifs contre B. subtilis. La tentative d'établir un modèle QSAR (relation quantitative structure-activité) avec les 17 flavonoïdes actifs n'a malheureusement pas été concluante car malgré l'obtention d'une régression linéaire largement acceptable (R²≈ 0,9), la validation par exclusion systématique d'un composé ("leave one out") n'a pas été obtenue. La seule explication plausible de cet échec est que le nombre de modes d'action présents est trop élevé pour un set de 17 composés, rendant ainsi caduque la modélisation QSAR. Au cours d'un crible de 67 mutants de B. subtilis, huit gènes impliqués dans la réponse aux flavonoïdes (naringénine et pinocembrine) ont été identifiés, dont deux appartiennent au régulon LmrA/QdoR, déjà identifié dans la littérature pour répondre aux flavonoïdes. Les souches B. subtilis ∆lmrA et ∆qdoI sont respectivement plus sensibles et plus résistantes vis-à-vis de la naringénine et de la pinocembrine. Les 17 flavonoïdes précédemment identifiés et actifs envers B. subtilis induisent une réponse transcriptionnelle propre à chacun d'après notre analyse de l'activité de 10 promoteurs avec l'utilisation de fusions transcriptionnelles avec un gène rapporteur. Cette analyse est cohérente avec l'étude transcriptomique menée pour la caractérisation de la réponse de B. subtilis en présence de 5 flavonoïdes ; la 2’hydroxyflavanone, la bavachine, la naringénine, la pinocembrine et le résokaempférol. De ce travail ressort plusieurs modes d'action des flavonoïdes chez B. subtilis, impliquant l'induction de la réponse stringente, l'inhibition de voies métaboliques pour la synthèse des membranes et paroi cellulaires et l'inhibition du métabolisme carboné central.