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Application de la métabolomique dans la mise en évidence d'administration de stimulants de l'érythropoïèse chez l'athlète et chez le cheval de course : exemple du CERA

par Céline Jore

Thèse de doctorat en Biologie Santé

Sous la direction de Michel Audran.

Thèses en préparation à Montpellier , dans le cadre de Sciences Chimiques et Biologiques pour la Santé , en partenariat avec IBMM - Institut des Biomolécules Max Mousseron (laboratoire) .


  • Résumé

    LLes agents stimulants de l'érythropoïèse (ESAs, Erythropoiesis Stimulating Agents) font, avec les anabolisants, probablement partie des substances dopantes les plus attractives. Les ESAs utilisés à la fois chez l'homme et chez le cheval permettent d'augmenter l'oxygénation des tissus musculaires et donc la performance sportive particulièrement dans les sports d'endurance. Outre leur coût élevé, les méthodes directes d'analyse des ESAs comportent des inconvénients : − elles ne peuvent détecter que les molécules connues ignorant les « designers drugs » − les fenêtres de détection de ces molécules dépendent de leur demi-vie qui peut être très courte selon la nature et le mode d'administration de l'ESA. Il est donc nécessaire de tenter d'améliorer la détection de l'usage de ces substances à l'aide de méthodes indirectes. Notre hypothèse est que la totalité des ESAs sur le marché ayant le même mode d'action ils produiront les mêmes effets sur le métabolome. En étudiant le métabolome et ses modifications au cours et suite à une administration d'ESA, nous pourrions suspecter l'utilisation de n'importe quel ESA. Pour cela une étude clinique humaine (n=10) et une expérimentation animale équine (n=3) ont été mises en place. Des échantillons sanguins et urinaires ont été prélevés avant et après administration unique de méthoxy polyéthylène glycol-époétine bêta (Mircera®). Parallèlement à la mesure des paramètres hématologiques, des analyses électrophorétiques (IEF/ SAR PAGE) et des analyses immuno-enzymatiques (ELISA), nous ont également permis de suivre l'évolution de la concentration en érythropoïétine humaine. Les échantillons humains et équins (sang et urine), ont été analysés par approche métabolomique non ciblée par RMN 1D et par LC HRMS. Les données ainsi recueillies ont subi un traitement du signal optimisé avant d'être analysées grâce à des méthodes statistiques multivariées. Les analyses sanguines ont montré un effet de l'administration de Mircera® à la fois chez l'homme (sur le pourcentage de réticulocytes) et chez le cheval (sur l'hématocrite). Les analyses IEF/SAR-PAGE et ELISA, méthodes de références dans le contrôle antidopage humain et équin, respectivement, ont révélé que la molécule était détectable jusqu'à 20 à 30 jours après administration en fonction des individus. Après la mise au point de méthodes de préparations et de mesures dédiées, les empreintes métaboliques globales urinaires et plasmatiques ont été acquises par RMN 1D et par LC-HRMS. Des outils statistiques ont été mis au point chez l'homme (LC-HRMS) et chez le cheval (RMN et LC-HRMS) afin de prédire l'appartenance d'un échantillon à la catégorie Contrôle (négatif) ou Traité (positif à un ESA). Ces modèles ont mis en évidence des différences ces deux catégories sur une période d'au moins 56 jours chez l'homme et 74 jours chez le cheval après administration, soit 25 et 44 jours de plus qu'avec les analyses de références actuelles (SAR PAGE et ELISA, respectivement).

  • Titre traduit

    Metabolomic application for proving administration of erythropoiesis stimulating agents in athlete and race horse : CERA example


  • Résumé

    Erythropoiesis Stimulating Agents (ESAs) are one of the most interesting doping drugs with anabolic steroids. The same drugs are used for human and equine doping to improve the oxygenation of muscle tissues and therefore sports performance. However ESAs are not routinely controlled because of high costs and direct methods drawbacks: − only the targeted molecules can be detected while drug design is in expansion − the detection window depends of the molecule half-life depending on the nature of the ESA. ESAs detection improvement is thus needed by developing indirect methods. In our hypothesis, all ESAs on the market (or in third phase of clinical trials) could have the same pathway and so they should have the same effects on metabolism. By studying metabolome and its variations during an ESA administration it could be possible to prove the use of any ESA with a single method. A clinical trial on human (n=10) and an animal experimentation on horse (n=3) were carried out with blood and urine sample collection before and after administration of methoxy polyethylene glycol-epoetin beta (Mircera®). Not only haematological analyses were performed but also electrophoretic methods (IEF/SAR PAGE) and enzyme immunoassays (ELISA) to follow the evolution of human erythropoietin concentration. In addition urine and blood metabolic fingerprints were recorded by 1D NMR and LC-HRMS. Dataset was first preprocessed with optimal methods according to the different matrices and then processed with multivariate statistical methods to find out candidate biomarkers for ESA abuse. Blood count showed notable effects after Mircera® administration on reticulocyte percentage in human and on hematocrit in horse. Despite the high doses of Mircera® administered, IEF/SAR-PAGE and ELISA, reference methods in human and equine doping control, respectively, showed that the drug is detected within 20 to 30 days according to subjects and horses. After optimization of dedicated sample preparations, human and equine samples of blood and urine were analyzed by 1D NMR and LC-HRMS untargeted metabolomic approach. Multivariate statistics models were built for human (LC-HRMS) and for equine data (NMR and LC-HRMS) to predict sample status: Control (negative) or Treated (positive to ESA). Those models discriminate these 2 classes until 56 (human) and 74 days (horse), i.e. 25 and 44 more days than current reference methods (SAR-PAGE and ELISA, respectively).