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Analyse moléculaire de la progression des cancers bronchiques non à petites cellules. MicroARN - Transition épithélio-mésenchymateuse - Recherche de signatures pronostiques.

par Antoine Legras

Thèse de doctorat en Biologie moleculaire

Sous la direction de Helene Blons et de Pierre Laurent-puig.

Thèses en préparation à Sorbonne Paris Cité , dans le cadre de École doctorale Médicament, toxicologie, chimie, imageries .


  • Résumé

    La prise en charge du cancer bronchique non à petites cellules (CBNPC) n'a cessé de progresser et les résultats sur la survie de s'améliorer avec actuellement une survie globale à 5 ans après chirurgie de 49,8%, tous stades chirurgicaux confondus. Tout d¿abord nous avons revu l'évolution des pratiques chirurgicales sur 32 ans (de 1979 à 2010, incluant 6105 patients consécutifs) permettant de constater une modification des techniques avec une amélioration de la survie pour une mortalité péri-opératoire stable à 4%. Malgré ces progrès, le CBNPC reste une cause majeure de décès. L'apparition de métastases et de résistance au traitement sont les principaux facteurs qui contribuent à la récidive puis au décès. Nous avons fait l'hypothèse que l'existence d'altérations moléculaires, évaluées par séquençage haut débit ciblé, pouvait impacter le pronostic de la maladie après chirurgie. Tout d'abord, la technologie a fait l'objet d'une validation de méthode et d'une revue exhaustive des données de soin courant. Les données moléculaires issues du soin pour 1568 patients consécutifs analysés en 2015 et 2016 et atteints d'une tumeur pulmonaire ont été revues et ont permis de montrer la présence d'au moins 1 altération dans 75% des cas (1, 2, 3 et 4 altérations ou plus dans 41%, 28%, 6%, et 0,7 % des cas respectivement), l'existence de mutations récurrentes (EGFR 15%, KRAS 27%, BRAF 4%, TP53 41%, STK11 7%) et un gain diagnostique en terme de cible thérapeutique potentielle dans 16% des cas. Ensuite nous avons analysé la transition épithélio-mésenchymateuse (TEM) comme marqueur pronostique chez les patients opérés. La TEM est processus dynamique cellulaire et moléculaire, largement étudié comme facteur de progression tumorale, et associé à l'acquisition par les cellules tumorales de marqueurs spécifiques, marqueurs de cellules souches par exemple, et à un gain de mobilité cellulaire. Nous avions montré une interaction entre l'activation de la voie de l'EGFR et la TEM via la réactivation de TWIST1. Nous avons poursuivi l'analyse de ce modèle grâce au séquençage à très haut débit (MIRseq, Integragen) et l'analyse des niveaux d'expression des micro-ARNs (miRs) sur une série de 25 CBNPC opérés et mutés EGFR. Les miRs significativement associés à une TEM ont ensuite été validés par une seconde technique (Fluidigm, Integragen) sur la même série et 2 miRs, le miR-200a-3p et le miR-429, étaient significativement associés à une TEM dans ce modèle. La dernière étape est l'analyse de l'impact pronostique de ces miRs dans une série indépendante que nous avons mise en place, OncoHEGP, incluant 182 patients opérés entre 2011 et 2013, dont les tumeurs ont fait l'objet d'une caractérisation moléculaire large (panel 22 gènes, et analyse de l'expression de 10 marqueurs de la TEM en RT-qPCR). Enfin, nous avons cherché à identifier une signature pronostique dans un sous-groupe particulier de patients de stade IIIA-N2 opérés, en nous intéressant à la tumeur et aux ganglions pour évaluer l'hétérogénéité moléculaire. Dans un travail préliminaire, nous avons réalisé la caractérisation moléculaire et cellulaire (PD-1, PD-L1 et CD8) d'une petite série de 4 patients. Nous avons ensuite élargi à 2 groupes de 9 patients (groupe A, long survivants vs groupe B, récidive précoce) pour lesquels une approche génomique, transcriptionnelle et protéomique via la technologie Nanostring (Nanostring Technology) permettra une analyse approfondie du cancer primitif et du ganglion. Ce travail doit permettre d'identifier des marqueurs pronostiques associés à une longue survie chez ces patients IIIA-N2. Enfin il doit mener à une étude prospective nationale multicentrique de validation, laquelle fait l'objet d'une candidature à l'appel d'offre INCa PRT-K 2017. En conclusion, ce travail s'inscrit dans la volonté d'approfondir la caractérisation moléculaire du CBNPC et d'identifier les déterminants pronostiques pour améliorer la prise en charge des patients.

  • Titre traduit

    Molecular analysis of progression of non small cell lung cancer. Micro-RNA - Epithelial-to-mesenchymal transition - Prognostic signatures.


  • Résumé

    Management of non-small cell lung cancer (NSCLC) is getting better and results on long-term survival have improved with global 5-year survival rate of 49.8 % after surgery, whenever the stage. First, we reviewed the evolution in surgical practices over a 32-year period (from 1979 to 2010, including 6105 consecutive patients) and observed changes in technics and increased survival with stable perioperative morbidity (4%). Despite these advances, NSCLC remains a major cause of death. Metastasis and drug resistance are the main factors contributing to relapse and death. We hypothesized that molecular alterations, assessed by high throughput sequencing, could impact disease prognosis after surgery. First, the technology was validated. We reviewed routine-care data from 1568 consecutive patients in 2015 and 2016 with NSCLC. We showed that at least one alteration was found in 75% of cases (1, 2, 3 and 4 alterations or more in 41%, 28%, 6%, and 0,7 %), that some mutations were recurrent (EGFR 15%, KRAS 27%, BRAF 4%, TP53 41%, STK11 7%) and that a potentially clinically actionable target was found in 16% of cases. Secondly, we analyzed epithelial-to-mesenchymal transition (EMT) as prognostic marker after surgery. EMT is a complex dynamic molecular and cellular process involved in tissue remodelling that was extensively studied as an actor of tumour progression and that is associated to cell mobility and stem cell features. We previously showed association between EGFR pathway and EMT via TWIST1 reactivation. To go further in the analyze of this model, we performed high throughput sequencing (MIRseq, Integragen) and micro-RNAs (miRs) expression levels analysis on a 25 operated EGFR-mutated NSCLC series. Significant EMT-associated miRs were then validated using a second method (Fluidigm, Integragen) on the same series and 2 miRs (miR-200a-3p and miR-429) were significantly associated to EMT in this model. The final step is the analysis of prognostic impact of these 2 miRs, using an independent series that we implemented (OncoHEGP), including 182 operated patients, between 2011 and 2013, whose tumours were largely characterized (22 genes panel and expression analysis of 10 EMT markers using RT-qPCR). Third, we tried to identify a prognostic signature within a subset of patients, stage IIIA-N2, after surgery, studying molecular heterogeneity within primary tumour and associated lymph nodes. In a preliminary study, we performed molecular and cellular (PD-1, PD-L1 and CD8) characterization in a small series of 4 patients. We then widened the approach to 2 groups of 9 patients (group A, long survivors vs group B, early relapse) for genomic, transcriptomic and proteomic analyses (Nanostring technology) to deeply analyze primary NSCLC and lymph nodes. This work should lead to identify prognosis markers associated with long survival for these IIIA-N2 patients. Finally, it should lead to a prospective national multicentric validation study, which is the subject of an application to INCa PRT-K 2017 invitation. In conclusion, this work is part of the wish to go further in NSCLC molecular characterization and to identify prognostic actors, in order to improve patients¿ management.