Etude du mécanisme de translocation de la toxine CyaA de bordetella pertussis

Study of the translocation mechanism of the CyaA toxin from bordetella pertussis

• Auteur / Autrice : Alexis Voegele
• Direction : Alexandre Chenal
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Aspects moléculaires et cellulaires de la biologie. Microbiologie
• Date : Soutenance le 10/10/2019
• Etablissement(s) : Université Paris Cité
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Bio Sorbonne Paris Cité (Paris ; 2014-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Unité Biochimie des interactions macromoléculaires (Paris)
• Jury : Président / Présidente : Claudine Mayer
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Alexandre Chenal, Claudine Mayer, Holger Barth, André Matagne, Nicolas Rodriguez, Marie-Béatrice Valerio-Lepiniec
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Holger Barth, André Matagne

Mots clés

Mots clés contrôlés

Toxine d'adénylate cyclase

Translocation (génétique)

Calmoduline

Bordetella pertussis

Mots clés libres

Propriétés membranaires

Membrane-active peptide

Résumé

La toxine adénylcyclase (CyaA) est un des principaux facteurs de virulence produite par Bordetella pertussis, l’agent de la coqueluche. CyaA a l’unique capacité de transloquer son domaine catalytique directement à travers la membrane plasmique. Puis le domaine catalytique lie la calmoduline (CaM) pour produire de grandes quantités d’AMPc, conduisant à l’intoxication de la cellule. Bien que plusieurs modèles aient été proposés, le mécanisme moléculaire et les forces impliquées dans la translocation de CyaA restent peu connus. Un gradient de calcium, un potentiel de membrane et des acylations post-traductionnelles sont requis pour la translocation de CyaA. Pendant mon doctorat, je me suis principalement intéressé au processus de translocation. Il a été montré précédemment que la suppression de la région de translocation abolit le passage du domaine catalytique. Dans cette région, le peptide P454 (résidus 454 à 484 de CyaA) a été identifié et montre des propriétés membranaires, i.e interaction avec la membrane, repliement en hélice α au contact de la membrane et perméabilisation membranaire. Nous avons étudié le rôle de P454 dans le processus de translocation. Nous avons observé que des lipides fluides et chargés négativement favorisent l’insertion de P454 dans les membranes. Le peptide possède deux arginines qui sont impliquées dans ses activités membranaires. P454 possède aussi la capacité de transloquer à travers la membrane et de former un complexe avec la CaM. Nous avons identifié plusieurs résidus de P454 impliqués dans la liaison à la membrane et la CaM. Dans le contexte de la toxine entière, ces résidus sont essentiels pour la translocation du domaine catalytique et la production d’AMPc. On propose un modèle de translocation dans lequel le segment P454 de la région de translocation déstabilise la membrane, favorisant sa translocation. Dans le cytosol, le segment P454 est piégé par la CaM et le complexe pourrait agir comme une force tirant le domaine catalytique à travers la membrane. Nous avons aussi montré que la liaison à la CaM du peptide liant la CaM dans le domaine catalytique induit des effets allostériques qui stabilisent le site catalytique, permettant la catalyse rapide d’ATP en AMPc. La pertinence de ces résultats pour la translocation et l’activation de CyaA sont discutées.

The adenylate cyclase toxin (CyaA) is one of the major virulence factor produced by Bordetella pertussis, the causative agent of whopping cough. CyaA has the unique capacity to translocate its catalytic domain directly across the plasma membrane. Then, the catalytic domain binds to calmodulin (CaM) to produce high levels of cAMP, leading to cell intoxication. Although several models have been proposed, the molecular mechanism and the forces involved in the translocation of CyaA remain elusive. The calcium gradient, the membrane potential across the plasma membrane and post-translational acylation are required for an efficient CyaA translocation. During my PhD, I mainly investigated the translocation process. It has been previously shown that deletion of the translocation region abolishes the delivery of the catalytic domain into the cytosol of target cells. In this region, the peptide P454 (residues 454 to 484 of CyaA) was identified and exhibits membrane-active properties related to antimicrobial peptides, i.e membrane interaction, α-helical folding upon membrane insertion and membrane permeabilization. We have investigated the role of P454 on the translocation process. We observed that negatively charged and fluidic membrane favor P454 membrane insertion. The peptide contains two arginine residues that are critically involved in its membrane-active properties. We further identified that P454 exhibits the intrinsic propensity to translocate across lipid bilayers and forms a stable complex with CaM. We identified several residues from P454 involved in both membrane interaction and CaM binding. We showed in the context of the full-length CyaA toxin that these residues are essential for the efficient translocation of the catalytic domain into the cell and production of cAMP. We propose a translocation model in which the membrane-active P454 segment from the translocation region destabilizes the membrane, favoring its translocation. In the cytosol, the P454 segment is trapped by CaM and the formation of the complex may act as a driving force pulling the catalytic domain across the plasma membrane. We further showed that CaM binding to the main CaM-binding site in the catalytic domain induces local and long-range allosteric effects that stabilize the enzymatic site, allowing fast ATP catalysis to cAMP, leading to host subversion. The relevance of these results for the translocation and activation of CyaA are discussed.