Caractérisation d’activités oxydo-réductases, leur expression et régulation : applications pour le diagnostic in vitro

Characterization of oxidase-reductase activities, their expression and regulation system : outcomes for in vitro diagnosis

• Auteur / Autrice : Valérie Chalansonnet
• Direction : Christophe Gilbert, Sylvain Orenga
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Microbiologie
• Date : Soutenance le 28/06/2016
• Etablissement(s) : Lyon
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Evolution Ecosystèmes Microbiologie Modélisation
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Centre International de Recherche en Infectiologie (Lyon ; 2013-....)
• Partenaire(s) de recherche : établissement opérateur d'inscription : Université Claude Bernard (Lyon ; 1971-....)
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Christophe Gilbert, Patricia Doublet
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Ivan Matic, Anthony Romieu, Jacques Schrenzel

Mots clés

Mots clés contrôlés

Escherichia coli

Nitrofuranes

Oxydoréductases

Microorganismes

Mots clés libres

Azoréductase

Nitroréductase

Microorganismes

Régulation

Nitrofuranes

Résistance

Escherichia coli

Azoreductase

Nitroreductase

Microorganisms

Regulation

Nitrofurans

Resistance

Escherichia coli

Résumé

La réduction des liaisons azo (N=N) et des fonctions nitro (NO2) chez les bactéries est liée aux azoréductases et nitroréductases, enzymes catalysant ces réactions. Leur répartition homogène permet de les utiliser pour détecter les bactéries. Cette étude vise à confirmer leur intérêt comme marqueurs métaboliques, à optimiser les réactions enzymatiques pour la détection bactérienne et à approfondir la compréhension du lien entre l’activité nitroréductase et la résistance aux nitrofuranes.L’activité enzymatique est dépendante de la quantité d’enzyme, l’hypothèse d’une augmentation de la quantité de protéines pour accroitre l’activité et optimiser la détection des microorganismes a été testée. Le suivi de la transcription de gènes d’intérêt a permis d’observer une induction de leur transcription par des composés activateurs des mécanismes de régulation et certains substrats. L’ajout d’un inducteur transcriptionnel permet donc d’optimiser l’activité envers certains substrats et par conséquent la détection des bactéries. Ces études ont aussi contribué à identifier des liens entre structure moléculaire des substrats et capacité d’induction.La création et la caractérisation de différents mutants ayant des activités nitro- ou azoréductases altérées a permis de cribler de nouveaux substrats synthétiques en vue de leur utilisation dans des applications de diagnostic. Enfin, l’obtention et l’analyse génomique de souches obtenues par mutations aléatoire et ayant une résistance accrue à la nitrofurantoïne a mis en évidence un nouveau mécanisme de résistance, mécanisme qui apparaît également dans des isolats cliniques

Azo bond (N=N) and nitro reduction in bacteria is linked to the catalytic activities of azoreductase and nitoreductase enzymes, respectively. Their ubiquitous distribution enables their use for bacterial detection. This study aims to confirm their potential as metabolic markers, to optimize the enzymatic activities for improved detection and to generally enhance our understanding of azoreductase and nitroreductase activity . Enzymatic activity relies in part on protein quantity, increasing protein amount was tested as a solution for increased activity and improved bacterial detection. For that, the transcription of selected genes was followed in the presence of regulation system activators and substrates. Some of these compounds promoted an overexpression of selected enzymes and led to a better activity toward some substrates. Consequently, increasing the enzyme amount, through over transcription, can enable a better detection of bacteria. This study also contributed to the determination of structural elements required for induction by the substrate.Mutants with lowered azo or nitro reductase activity were constructed and used to screen new synthetic substrates which could be of use for in vitro diagnostic tests. Finally, strains with a high resistance to nitrofurantoin were obtained by random mutagenesis. Their genome analysis provided evidence for a new resistance mechanism, which can also be detected in clinical isolates