Evolution des transmissions glutamatergiques dans le cortex au cours du développement chez la souris : impact d'un anesthésique, la kétamine, sur le développement du R-NMDA

• Auteur / Autrice : Maryline Lecointre
• Direction : Isabelle Leroux-Nicollet, Sylvie Jégou
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biologie cellulaire - Neurosciences
• Date : Soutenance en 2014
• Etablissement(s) : Rouen
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Normande de biologie intégrative, santé, environnement (Mont-Saint-Aignan, Seine-Maritime)

Mots clés

Mots clés contrôlés

Récepteurs NMDA

Neurotransmetteurs

Récepteurs du glutamate

Kétamine

Croissance

Cortex cérébral

Résumé

Le glutamate est le principal neurotransmetteur excitateur du système nerveux central (SNC). Les transmissions glutamatergiques jouent un rôle majeur dans certains aspects du développement du SNC, en particulier la migration, la différenciation et la plasticité des circuits neuronaux. L’activation physiologique du récepteur sensible au N-Méthyl-D-Aspartate (R-NMDA) est particulièrement impliquée dans les effets développementaux du glutamate. De ce fait, un blocage ou une activation excessive de ce récepteur peut conduire à des dommages cellulaires. Le R-NMDA est un récepteur ionotrope hétérotétramérique perméable aux cations largement exprimé dans le SNC et constitué de différentes sous-unités (GluN1, GluN2A-D et GluN3A-B). Dans le cortex, il est composé de deux sous-unités GluN1 obligatoires liant le co-agoniste, glycine ou D-sérine, associées majoritairement à des sous-unités GluN2A et/ou GluN2B, liant le glutamate. La composition en sous-unités GluN2 du R-NMDA, donne au récepteur des propriétés pharmacologiques et électrophysiologiques distinctes. De plus, les R-NMDA contenant la sous-unité GluN2A seraient impliqués dans la survie cellulaire et ceux comportant la sous-unité GluN2B seraient impliqués dans la mort cellulaire. Les protéines PDZ, appartenant à la famille des MAGUK (membrane-associated guanylate kinase), notamment PSD95 (postsynaptic density 95) et SAP102 (synapse associated protein 102) interagissent avec les R-NMDA et jouent un rôle dans leur stabilisation membranaire. Récemment, il a été montré que l’interaction GluN2A/PSD95 jouait un rôle dans la maturation synaptique. Des agents pharmacologiques utilisés en anesthésie, comme la kétamine, sont des antagonistes du R-NMDA. Cet anesthésique présentant de nombreux avantages cliniques (faible impact sur les fonctions respiratoires et cardiaques), est utilisé en pédiatrie dans le but de sédater lors de gestes médicaux de courte durée. Cependant, plusieurs études expérimentales mettent en cause l’innocuité de l’utilisation de la kétamine. En effet, l’administration de kétamine entraîne une augmentation de la mort cellulaire apoptotique dans le cortex cérébral de souris nouveau-née. Par ailleurs, une étude récente du laboratoire a montré ex vivo dans le cortex de souris âgée de 2 jours, que la kétamine induit des effets différents sur la survie cellulaire selon les couches corticales considérées. Dans le cadre de cette thèse, dans une première partie, nous avons réalisé une étude comparative des conséquences de l’administration de kétamine in vivo, chez la souris nouveau-née (40 mg/kg s. C), en fonction de l’âge auquel celle-ci est injectée (jours postnataux 2, 5 ou 10). - A court terme, nous avons mesuré l’effet sur le développement cortical post-natal du R-NMDA et sur son association aux MAGUK. - A long terme, nous avons évalué l’impact de la kétamine administrée à différents âges postnataux, sur l’activité motrice mesurée à l’âge adulte dans deux contextes différents. Vingt-quatre heures après l’injection de kétamine, l’expression des protéines GluN2A et GluN2B est diminuée lorsque le traitement est réalisé respectivement à P5 ou P10. Après immunoprécipitation de la protéine d’adressage membranaire PSD95, la révélation par western blot indique que quelque soit l’âge du traitement, la kétamine entraîne une diminution de l’association de la sous-unité GluN2A à PSD95, tandis que le complexe GluN2B/PSD95 est augmenté uniquement lorsque le traitement est réalisé à P5. A ce stade, cette perturbation de l’expression des sous-unités GluN2A et GluN2B est associée à une diminution de la phosphorylation de ERK1/2 et une augmentation de la protéine nNOS liée à PSD95 et GluN2B. L’ensemble de ces résultats indique donc que la kétamine altère le profil développemental des sous-unités du R-NMDA, suggérant un retard dans la maturation synaptique. De plus, à P5, le traitement a des répercussions fonctionnelles sur les cascades de signalisation intracellulaire. La microdissection laser réalisée sur le cortex de souris contrôles, révèle une hétérogénéité de répartition des sous-unités du R-NMDA entre les couches corticales superficielles immatures (I-IV) et les couches corticales profondes matures (V-VI). La kétamine perturbe ce profil, en diminuant la sous-unité GluN2A dans les couches superficielles chez la souris traitée à P5 et en augmentant les sous-unités GluN1, GluN2A et GluN2B dans les couches profondes lorsque le traitement est réalisé à P10. A plus long terme, l’administration de kétamine à P2 ou P10 entraîne une hyperlocomotion en open-field, chez les souris mâles devenues adultes, sans aucun effet chez les femelles. La mesure de l’activité motrice volontaire durant 72 h dans une roue d’activité placée dans une cage de vie, révèle des altérations induites à l’âge adulte par la kétamine administrée en période périnatale, dépendantes de l’âge et du sexe. En conclusion, de cette première partie de thèse, une seule injection de kétamine quelque que soit l’âge de traitement en période périnatale, entraîne des modifications du profil développemental du R-NMDA à court terme et des altérations de l’activité motrice persistant à l’âge adulte. En dépit des progrès réalisés en obstétrique et en néonatologie, les lésions cérébrales du nouveau-né restent fréquentes (2 à 2,5 enfants pour 1000 naissances). Elles constituent la principale cause de décès et de handicaps moteurs acquis en période périnatale. De nombreux facteurs de risque sont identifiés, tels que la prématurité, les accidents hypoxo-ischémiques, les infections foeto-placentaires, les déficits hormonaux et les facteurs toxiques (alcool, drogues). Une activation excessive de la transmission glutamatergique est souvent à l’origine de lésions acquises en période périnatale. L’excès de glutamate entraîne une suractivation de ses récepteurs dont le R-NMDA, aboutissant in fine à la mort cellulaire par apoptose et/ou nécrose. La proximité des microvaisseaux cérébraux avec les cellules neurales et la présence de R-NMDA fonctionnels sur les cellules endothéliales microvasculaires cérébrales (CEMC) suggèrent une influence particulière des CEMC sur les neurones corticaux lors de phénomènes excitotoxiques. Les concentrations synaptiques de glutamate sont régulées grâce à des transporteurs ATP-dépendants, présents à la membrane des cellules gliales et des neurones. Cinq types de transporteurs sont connus (excitatory amino acid transporters ; EAAT) : les EAAT-1 et -2 sont principalement exprimés par les astrocytes et les EAAT-3 et -4 sont préférentiellement exprimés par les neurones. Récemment, il a été démontré que les EAAT-1, -2 et -3 étaient également exprimés par les cellules endothéliales vasculaires adultes, suggérant ainsi un rôle de l’endothélium dans le contrôle des concentrations extracellulaires de glutamate. Cependant, une étude récente effectuée dans notre laboratoire, montre des différences de sensibilité au glutamate entre les CEMC murines néonatales et adultes. Ainsi, dans le cadre de cette thèse, dans une seconde partie, nous nous sommes intéressés à l’expression des EAAT-1, -2 et -3 au sein des microvaisseaux corticaux de souris nouveau-nées et adultes, ainsi qu’à la capacité de recapture du glutamate par les CEMC. Nous avons montré que l’expression des EAAT-1, -2 et -3 au sein de l’endothélium cérébral était plus importante chez l’adulte que chez le nouveau-né et que la capacité de recapture du glutamate par les CEMC était plus efficace chez l’adulte que chez le nouveau-né. Cette étude indique donc qu’il existe une régulation du glutamate extracellulaire par les cellules endothéliales et que cette régulation dépend de l’âge.

Glutamate is the major excitatory neurotransmitter in the central nervous system (CNS). Glutamatergic transmission plays an important role in CNS development, including migration, differentiation and synaptic plasticity. Physiological activation of N-Methyl-D-Aspartate receptor (NMDA-R) is particularly involved in the developmental effects of glutamate. Therefore, a blocking or excessive activation of NMDA-R affects the cerebral development and particularly leads to cell death in neonate cortex. NMDA-R is a heterotetrameric ionotropic receptor, permeable to cations, widely expressed in the CNS and composed of different subunits (GluN1, GluN2A-D, GluN3A-B). In the cortex, it is composed of two obligatory GluN1 subunits which link the co-agonist, glycine or D -serine, mainly associated with GluN2A and/or GluN2B subunits which bind glutamate. GluN2 subunit composition of NMDA-R gives distinct pharmacological and electrophysiological properties. Moreover, GluN2A-containing NMDA-R are involved in cell survival and those containing GluN2B are involved in cell death. PDZ proteins, member of membrane-associated guanylate kinase family (MAGUK), including PSD95 (postsynaptic density 95) and SAP102 (synapse associated protein 102) interact with NMDA-R and play an important role in their membrane stabilization. Recently, it has been shown that GluN2A/PSD95 association played a role in synaptic maturation. Pharmacological agents used for anesthesia, such as ketamine, act as NMDA-R antagonists. This anesthetic with many clinical advantages (low impact on respiratory and cardiac functions) is used in pediatrics in order to sedate during short duration medical procedures. However, several experimental studies discussed the safety of the use of ketamine. Indeed, ketamine administration causes an increase in apoptotic cell death in the cerebral cortex of newborn mice. Moreover, a recent laboratory study showed, ex vivo, in the cortex of mice aged 2 days, that ketamine induced different effects on cell survival depending on cortical layers considered. In a first study, we conducted a comparative study of the effects of ketamine administration in vivo, in newborn mice (40 mg / kg sc), depending on the age at which this anesthetic was injected (postnatal days 2, 5 or 10). In the short term, we measured the ketamine effect on the cortical NMDA-R postnatal development and its association with MAGUK. In the long term, we evaluated the impact of ketamine administered at different postnatal ages, on motor activity measured in adulthood in two different contexts. Twenty-four hours after ketamine injection, GluN2B and GluN2A protein expression was decreased when the treatment was carried out at P5 and P10 respectively. After immunoprecipitation of scaffolding PSD95 protein, western blot revelation indicated that regardless of the age treatment, ketamine caused a reduction of the association of GluN2A subunit to PSD95, while the complex GluN2B/PSD95 was increased only when the treatment was performed at P5. At this stage, the disruption of GluN2A and GluN2B subunits expression was associated with a decrease in ERK1/2 phosphorylation and an increase in nNOS association with GluN2B/PSD95 protein complex. All these results therefore indicate that ketamine alter the developmental profile of NMDA-R subunits, suggesting a delay in synaptic maturation. In addition, at P5, ketamine treatment has functional impacts on intracellular signaling cascades. Laser microdissection on control mice cortex revealed a heterogeneous distribution of NMDA-R subunits between immature superficial cortical layers (I-IV ) and the mature deep cortical layers (V-VI). Ketamine disrupted this profile by decreasing GluN2A subunit expression in the superficial layers in P5-treated mice and increasing GluN1, GluN2A and GluN2B subunits in the deep layers when the treatment was performed at P10. In the long term, ketamine administration at P2 or P10 caused hyperlocomotion in an open field in adult males, with no effect in adult females. The measurement of voluntary motor activity during 72 h in a running-wheel placed in a life cage, revealed alterations in adulthood induced by ketamine administered in the perinatal period, dependent on age and sex. In conclusion of this first part of the thesis, a single injection of ketamine, whatever the age of treatment in the perinatal period, resulted in changes in the NMDA-R developmental profile in the short-term and alterations in motor activity persisting in adulthood. Despite the progress of obstetrics and neonatal reanimation, brain injury in newborns remain frequent (2 to 2. 5 children per 1000 births). They form the first cause of death or disability acquired in the perinatal period. Many risk factors are identified, such as prematurity, hypoxo-ischemic injuries, fetal-placental infections, hormonal deficiencies and toxic factors (alcohol, drugs). Excessive activation of glutamatergic transmission is frequently the cause of perinatally acquired lesions. Excess of glutamate leads to overactivation of its receptors including NMDA-R, leading to cell death by apoptosis and/or necrosis. The proximity of brain microvessels with neural cells and the presence of functional NMDA-R on brain microvascular endothelial cells (BMEC) suggest a particular influence of BMEC on cortical neurons during excitotoxic stress. Synaptic glutamate concentrations are regulated by ATP-dependent transporters, present in the membrane of glial cells and neurons. Five transporters subtypes are known (excitatory amino acid transporters; EAAT): EAAT1 and -2 are primarily expressed by astrocytes and EAAT3 and -4 are preferentialy expressed by neurons. Recently, it has been shown that EAAT1, -2 and -3 were also expressed by adult vascular endothelial cells, suggesting a role of endothelium in the control of extracellular glutamate concentrations. However, a recent laboratory study showed differences in glutamate sensibility between neonatal and adult murine BMEC. In a second study, we studied the expression of EAAT1, -2 and -3 in cortical microvessels of newborn and adult mice, as well as efficiency of glutamate uptake by BMEC. We showed that EAAT1, -2 and -3 expression in brain endothelium was greater in adults than in neonates, as well as the efficiency of glutamate uptake by BEMC. In conclusion of this second part of the thesis, this study indicates that there is a regulation of extracellular glutamate by endothelial cells and this control depends on the age. Low expression of EAAT in immature vascular endothelium could contribute to a particular sensitivity of newborn brain during excitotoxic stress in mice. In conclusion, this thesis contributed to characterize the specificity of glutamatergic transmission in the immature brain. Our results play in favor of special consideration of molecules interacting with glutamatergic transmission such as anesthetics in the perinatal period.