Identification de nouveaux acteurs de la régulation de la photosyhthèse

Proteomic and functional analysis of chloroplast and thylacoids sub-compartments

• Auteur / Autrice : Martino Tomizioli
• Direction : Giovanni Finazzi
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Sciences de la vie
• Date : Soutenance le 20/10/2014
• Etablissement(s) : Grenoble
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale chimie et science du vivant (Grenoble ; 199.-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Laboratoire de physiologie cellulaire végétale (Grenoble)
• Jury : Président / Présidente : Christelle Breton
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Daphné Seigneurin-Berny, Wojciech Majeran
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Christophe Robaglia, Michael Schroda

Mots clés

Mots clés contrôlés

Photosynthèse

Mots clés libres

Chloroplaste

Protéome

Photosynthèse

Thylacoïde compartiments

Chloroplast

Proteome

Photosynthesis

Thylacoïd compartments

Résumé

Chez les eucaryotes, la photosynthèse a lieu dans le chloroplaste, un organite spécifique de la cellule végétale et caractérisé par différents compartiments : (i) l'enveloppe, la double membrane qui délimite le chloroplaste ; (ii) le stroma, phase aqueuse principalement composée de protéines solubles et (iii) un système membranaire interne, les thylacoïdes, qui contiennent les complexes photosynthétiques. Les thylakoïdes forment un réseau tridimensionnel continu et sont différenciés en deux domaines physiques distincts : des empilements de vésicules de membrane (appelés granas ou BBY) et des extensions de membrane simple (lamelles stromales). Les complexes majeurs de la photosynthèse ne sont pas distribués de manière égale dans cette membrane à cause de contraintes électrostatiques et stériques. Ainsi, le photosystème I et l'ATP-synthétase sont enrichis dans les granas, le photosystème II dans les lamelles stromales alors que d'autres complexes, comme le cytochrome b6f, auraient une répartition équivalente entre granas et lamelles stromales. Pour faire face aux variations environnementales de lumière (en qualité et quantité), les plantes ont développé des processus pour moduler leur capacité d'absorption et d'utilisation de la lumière par les photosystèmes, processus regroupés sous le terme de « quenching non photosynthétique ou NPQ ». Dans le cadre de ma thèse, je me suis intéressé à deux composants du NPQ, les états de transition et la dissipation sous forme de chaleur (partie qE).Le premier objectif de ma thèse a été d'identifier de nouveaux acteurs impliqués dans les transitions d'état et ceci en étudiant la relocalisation de protéines au sein des sous-compartiments des thylacoïdes par une approche protéomique. En effet, il a été montré que certaines antennes collectrices de lumière sont réorganisées dans les membranes photosynthétiques lors des transitions d'état. Jusqu'à présent, aucune description exhaustive de la composition et distribution des protéines dans les sous-compartiments de thylacoïdes n'avait été réalisée. J'ai donc dans un premier temps développé des protocoles de purification des sous-compartiments des thylakoïdes (granas et lamelles stromales) à partir de chloroplastes de plantes sauvage d'Arabidopsis thaliana. Ensuite, grâce à une approche d'analyse protéomique semi-quantitative, nous avons pu déterminer la localisation d'environ 300 protéines des thylacoïdes. Les résultats suggèrent que la localisation de complexes photosynthétiques est beaucoup plus dynamique que celle jusqu'à lors proposée. En effet, même s'ils sont préférentiellement identifiés dans un sous-compartiment, certains complexes photosynthétiques présentent une double localisation qui était inattendue. De plus, la composition en sous-unités de ces complexes diffère selon leur localisation, dans les granas et dans les lamelles stromales, suggérant l'existence de processus de régulation de la photosynthèse jusqu'à lors insoupçonnés. Cette approche a ensuite été appliquée sur des plantes mutantes d'Arabidopsis affectées dans les transitions d'état afin d'identifier des protéines pouvant être impliquées dans ce processus d'adaptation. En parallèle, je me suis intéressé au qE . L'activation de ce mécanisme n'est pas constitutive et nécessite la formation d'un gradient de pH entre le stroma et le lumen des thylacoïdes (ΔpH). L'objectif de l'étude a été d'identifier des acteurs pouvant contrôler la formation de ce gradient de pH. Pour cela, nous nous somme focalisés sur le rôle d'un transporteur de potassium récemment caractérisé, TPK3. Grâce à des approches biophysiques et biochimiques, nous avons démontré que TPK3 est impliqué, in vivo, dans la modulation des deux composantes de la force proton motrice (pmf), le gradient de pH (ΔpH) et la différence de potentiel (Δψ). En contrôlant la répartition de la force proton motrice,TPK3, permet une utilisation correcte de la lumière en dissipant l'excès d'énergie.

Within higher plants and algae, photosynthesis is carried out in the chloroplast. Structurally, chloroplasts are organized in (i) the envelope, a double membrane system surrounding the chloroplast (ii) the stroma, the aqueous space which mainly contains soluble proteins and the (iii) thylakoids, a three-dimensional membrane network where photosynthetic electron transport reactions occur. Thylakoids are non-homogeneously folded, and comprise two major domains: (i) the grana-BBY, which are stacks of thylakoids particularly enriched in photosystem II, LHCII (the antenna-protein complex responsible for light harvesting) and (ii) the stroma lamellae, which are unstacked thylakoids connecting grana stacks enriched in photosystem I and ATP synthase. Plants can respond to changes in the environmental light conditions by several means as those which are collectively called non-photochemical quenching or NPQ. During my thesis, I mainly focused on two components of the NPQ: state transition (qT) and high-energy state quenching (qE).State transitions is the process by which PSII-antenna proteins are re-organized between stroma-lamellae and grana-BBY following changes in ambient light both of intensity and spectral composition. State transitions play a key role in the plant adaptation but many aspects of this process remain unclear. The main objective of my thesis was to study the thylakoid protein re-localization between stroma-lamellae and grana-BBY during state transitions using a proteomic-based approach. At this aim I firstly focused on the sub-thylakoid protein localization in Arabidopsis WT and I developed different protocols for the purification of the two sub-compartments (stroma-lamellae and grana-BBY) starting from intact chloroplasts. Later, thanks to a semi-quantitative proteomic approach, I determined the precise localization of around 300 thylakoid proteins in Arabidopsis WT. Results suggested that the localization of the different photosynthetic complexes is much more dynamics than previously hypothesized. In fact, even if characterized by a preferential localization, some photosynthetic complexes displayed an unexpected double localization. Moreover the subunit composition of these complexes was found to vary according to their localization (BBY or stroma-lamellae) suggesting the existence of mechanisms of regulation which have never been evidenced before. Later, we used the same mass-spectrometry-based approach on two different Arabidopsis mutants unable to perform state transitions. The objective was to highlight the involvement of other proteins (other than LHCII) which could possibly be re-localized within the photosynthetic membrane during state transitions. In the second part of my thesis, I focused on the high-energy state quenching component of the NPQ. qE allows the plant to dissipate excessive light energy as heat. This process it's not constitutive but need to be activated by the formation of a difference in the pH between the stroma and the thylakoid lumen (ΔpH). The objective of the study was to identify new possible actors in the regulation of the ΔpH formation. At this purpose I focused on a recently characterized potassium channel, TPK3. Thanks to a biophysical and biochemical approach, we demonstrated that TPK3 is involved, in vivo, in the modulation of the two components of the proton motive force (pmf), the ΔpH and the difference in the electric field Δψ. By controlling the repartition of the pmf, TPK3, controls also the formation of the NPQ and directly affects light utilization and dissipation in vivo. This avoids serious damages to the photosynthetic chain when plants are exposed to high-light conditions