Analyse protéomique de la vacuole de Brucella abortus : la glycéraldéhyde-3-phosphate déhydrogénase (GAPDH) et la G Rab 2 sont indispensables pour sa réplication intracellulaire

Proteomic analysis of the Brucella-containing vacuole : the glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) and the small GTPase Rab 2 are crucial for its intracellular replication

• Auteur / Autrice : Emilie Fugier
• Direction : Jean-Pierre Gorvel
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biologie des eucaryotes. Immunologie
• Date : Soutenance en 2008
• Etablissement(s) : Aix-Marseille 2
• Ecole(s) doctorale(s) : Ecole Doctorale Sciences de la Vie et de la Santé (Marseille)

Mots clés

Mots clés contrôlés

Protéomique

Brucellose

Brucella

Résumé

Brucella est un pathogène bactérien intracellulaire responsable de la brucellose animale et humaine. Des études in vitro ont démontré que Brucella est capable de contourner la voie d’endocytose pour assurer sa survie intracellulaire à la fois dans les cellules phagocytaires et nonphagocytaires. Les brucelles assurent leur réplication par la biogenèse d’une vacuole de réplication issue du réticulum endoplasmique (ER) appelée « Brucella-containing vacuole » (BCV). L’identification de protéines spécifiques localisées sur la membrane de la BCV est essentielle pour comprendre comment Brucella est capable de maintenir ces interactions avec le ER et de continuer à se répliquer au sein de ce compartiment. Nous avons caractérisé pour la première fois la composition protéique de sa niche de réplication par des approches protéomiques. Pour cela, nous avons développé une méthode de fractionnement subcellulaire afin d’isoler les BCV. L’analyse de la composition protéique de la membrane de la BCV par électrophorèse sur gel en 2 dimensions et par spectrométrie de masse a permis l’identification de plusieurs protéines eucaryotes et procaryotes. Nous avons obtenu des protéines du ER et des protéines ribosomales qui valident le modèle : la niche de réplication de Brucella est une vacuole qui dérive du ER. De plus, nous avons identifié plusieurs protéines eucaryotes et bactériennes pouvant contribuer à la virulence de Brucella dans les cellules hôtes. Nous avons focalisé notre étude sur 2 protéines eucaryotes : la glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) et la petite protéine G Rab 2, qui sont recrutées au niveau de la vacuole de Brucella. Ce complexe a été décrit précédemment pour être localisé sur les vésicules et les tubules de transport (VTC) et pour réguler le trafic des membranes des VTC entre le ER et l’appareil de Golgi. La destruction de l’appareil de Golgi par des traitements prolongés à la bréfeldine A réduit la réplication de B. Abortus. De plus, l’inhibition de l’expression de GAPDH par l’ARN interférence et le blocage de Rab 2 dans sa forme GDP inhibent fortement la réplication de B. Abortus. Ces résultats révèlent un rôle essentiel pour GAPDH et Rab 2 dans la virulence de B. Abortus à l’intérieur des cellules.

Brucella is a facultative intracellular pathogenic bacteria which causes severe infections and abortion in animals and a long-lasting febrile disease in humans. Essential to Brucella virulence is its ability to survive and replicate inside host cells. In vitro studies showed that Brucella initially avoids or escapes the endocytic pathway to ensure its intracellular survival both in phagocytic and nonphagocytic cells. Bacteria secure their replication via the biogenesis of an endoplasmic reticulumderived replicative organelle named “Brucella-containing vacuole” (BCV). Identification of specific proteins on the BCV membrane is essential to understand how Brucella sustain interactions with the endoplasmic reticulum (ER) and keeps replicating within its compartment. We characterize for the first time the protein composition of its replicative niche by proteomic approches. We developed a subcellular fractionation method to isolate BCVs. The analysis of BCV membrane proteins by 2 dimensional gel electrophoresis and mass spectrometry allowed the identification of several eukaryotic and prokaryotic proteins. We obtained ER proteins and ribosomal proteins that validate the model: the replicative niche of Brucella is an ER-derived vacuole. Furthermore, we have identified several interesting host proteins as well as some bacterial proteins that may contribute to Brucella virulence within host cells. We focused our study on two eukaryotic proteins: glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) and the small GTPase Rab 2, which are recruited to the vacuolar membrane of Brucella. This complex was previously described to localize on vesicular and tubular clusters (VTC) and to regulate the VTC membrane traffic between ER and Golgi. Disruption of the Golgi apparatus with prolonged brefeldin A treatment reduced B. Abortus replication. Furthermore, inhibition of GAPDH expression by small interfering RNA and blockage of Rab 2 GTPase in a GDP-locked form strongly inhibited B. Abortus replication. These results reveal an essential role for GAPDH and the small GTPase Rab 2 in B. Abortus virulence within host cells.