Caractérisation de l'alternane-saccharase de Leuconostoc mesenteroides NRRL B-1355 : approche rationnelle et aléatoire pour la conception de nouvelles glucane-saccharases

Caracterisation of alternansucrase from Leuconostoc mesenteroides NRRL B-1355 : rational and random approach for the design of new glucansucrases

• Auteur / Autrice : Gilles Joucla
• Direction : Magali Remaud
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biologie - Santé. Biotechnologie
• Date : Soutenance en 2003
• Etablissement(s) : Toulouse, INSA

Mots clés

Mots clés contrôlés

Glycosyltransférases

Saccharose

Polymérisation

Mutagénèse dirigée

Évolution moléculaire

Résumé

L'alternane-saccharase (ASR) catalyse, à partir de saccharose, la formation d'un polymère de glucose associé par des liaisons osidiques a-1,6 et a-1,3 alternées. L'objectif de l'étude était de caractériser l'ASR, dont la spécificité est unique dans la famille 70 des glycoside-hydrolases, pour avancer dans la compréhension du mode de synthèse du polymère et de la formation des liaisons alternées. Dans un premier temps, l'expression hétérologue du gène asr dans E. Coli a montré que l'enzyme était faiblement produite et fortement dégradée. La forme ASR C-del (161 kDa), tronquée des séquences répétées de type " APY " et obtenue par délétion du gène asr, a permis de multiplier par un facteur 120 le niveau de production de l'enzyme. Cette forme est très peu dégradée ce qui rend possible la caractérisation de l'activité. L'étude montre que le polymère est synthétisé à partir de l'extrémité non réductrice par transfert successif sur du glucose. S'opposant au mécanisme couramment admis pour les glucane-saccharases, il devra être étayé par des données structurales. Un procédé permettant de produire efficacement l'enzyme et de la purifier a été établi pour pouvoir initier les expériences de cristallisation. D'après des travaux de mutagénèse, le fragment 768YDA770 s'est révélé impliqué dans la spécificité d'alternance. Cependant l'absence de données structurales limite l'identification de nouvelles cibles. C'est pourquoi, nous avons créé des banques de variants par mutagénèse aléatoire et recombinaison, et développé des méthodes de criblage pour l'isolement de variants plus actifs et dépourvus d'activité ASR. Les protocoles ont été testés avec succès sur une fraction de la banque

The alternansucrase (ASR) synthesizes from sucrose an homopolymer of glucose with a-1,6 and a-1,3 alternanted glucosidic linkages. The aim of this work was to characterise the ASR to understand the polymer synthesis and the process for alternanting the linkages which is unique in the 70 family of glucoside-hydrolases. Expression of asr gene in E. Coli led to low production and to degraded forms of the enzyme. However, the form ASR C-del (161 kDa), which is genetically truncated from "APY" amino acids repeated sequences, allowed a 120 fold increase in production without any degradation. Characterisation of the enzyme activity showed that the polymer is synthesized from the non-reducing end with successive transfers on glucose, the initial acceptor. Furthermore, sequence analysis followed with mutant constructions showed that the 768YDA770 fragment has a significant role in the alternating synthesis process. All theses results need to be confirmed by structural data. Thus, we developed a purification process to purify the ASR C-del in order to initiate crystallization experiments. To avoid limited design by the site directed mutagenesis without 3D structure, we generated libraries of variants of ASR C-del by random mutagenesis and combinatorial engineering and developed screening assays to isolate mutants more actives or affected in alternating function. Protocols were successfully set up and tested with the recent high throughput platform