Caractérisation des réponses inflammatoires dans les PBMC grâce au séquençage en cellules uniques

Characterization of inflammatory response in PBMCs using single-cell RNA sequencing

• Auteur / Autrice : Camille Challend de Cevins
• Direction : Mickaël Ménager
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Immunologie
• Date : Soutenance le 29/09/2022
• Etablissement(s) : Université Paris Cité
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Bio Sorbonne Paris Cité (Paris ; 2014-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Institut des Maladies Génétiques (Paris)
• Partenaire(s) de recherche : Entreprise : Sanofi (2004-....)
• Jury : Président / Présidente : Pauline Soulas-Sprauel
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Pauline Soulas-Sprauel, Philippe Pierre, Alain Fischer, Pierre Milpied, Emmanuelle Six
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Pauline Soulas-Sprauel, Philippe Pierre

Mots clés

Mots clés contrôlés

Séquençage de l'ARN

Analyse en cellule unique

Maladies auto-inflammatoires

Interférons

Mots clés libres

Single-cell RNA-seq

Interféron

SAVI

STING

MIS-C

Single-cell RNA-seq

Interferon

SAVI

STING

MIS-C

Résumé

Les interférons (IFN) de type I agissent comme des initiateurs de la réponse immunitaire. L'absence de réponse aux IFN peut entrainer des infections virales sévères. A l'inverse, la production incontrôlée d'IFN entraîne des inflammations chroniques. La voie cGAS-STING joue un rôle important dans la détection des fragments d'ADN cytoplasmiques et déclenche une réponse immunitaire en initiant la production d'IFN. Des mutations gain-de-fonction dans STING1, qui code pour le Stimulator of Interferon Gene (STING), induisent une activation constitutive de STING qui conduit à une maladie auto-inflammatoire sévère appelée STING-associated vasculopathy with onset in infancy (SAVI). C'est une maladie génétique rare caractérisée par une atteinte pulmonaire et cutanée. Bien que la production d'IFN de type I soit considérée comme la cause principale des symptômes observés chez les patients, STING induit aussi des fonctions qui sont spécifiques à certains types cellulaires, et leur rôle dans le SAVI n'a pas encore été adressé. Nous avons collecté une cohorte de 5 patients atteints de SAVI et 7 contrôles, et avons exploré le transcriptome de leurs cellules mononuclées du sang (PBMC) en cellules uniques. Des échantillons avant et après traitement ont aussi été collectés, nous permettant d'évaluer l'effet du traitement aux niveaux cellulaire et moléculaire. Afin de mieux comprendre les caractéristiques du SAVI qui résultent directement de la production constitutive d'IFN de type I, nous avons stimulé des PBMC de donneurs sains avec de l'IFN-β. La comparaison de ces deux jeux de données a révélé une diminution des lymphocytes T effecteurs et des MAIT chez les patients SAVI. Nous montrons que les lymphocytes T des patients sont dans un état constant d'activation précoce, avec senescence et apoptose. Nous mettons en évidence un groupe de monocytes pathogéniques hautement inflammatoires qui expriment une forte signature de la voie de stress eIF2-ATF4 (ISR). La prédiction des communications intercellulaires suggère que ces monocytes sont responsables de l'hyperactivation des lymphocytes T. Ces résultats étendent la compréhension du SAVI et pourraient aider à améliorer les traitements. Nous identifions également un patient présentant une réponse au stress diminuée, et montrons une deuxième mutation germinale dans EIF2AK3, qui est activé par STING pour déclencher l'ISR. Un deuxième axe de ma thèse a porté sur le Multisystem Inflammatory Syndrome in Children (MIS-C). Les patients atteints de COVID-19 sévères présentent des symptômes qui évoquent ceux du SAVI. Cette observation nous a mené à nous impliquer dans la recherche contre la pandémie de SARS-CoV-2. Les infections pédiatriques étaient initialement considérées comme n'entrainant que peu de symptômes. Néanmoins, il a rapidement été montré que le SARS-CoV-2 pouvait entrainer un MIS-C, une inflammation systémique post-aigue se déclenchant quelques semaines après l'infection initiale. Les formes sévères sont compliquées par des myocardites, mais les mécanismes qui gouvernent leur apparition n'ont pas encore été explorés. Nous avons collecté une cohorte de patients MIS-C avec ou sans myocardites, et exploré leurs PBMC grâce à une approche multi-omique combinant des données de protéomique, et de transcriptomique aux niveaux global et unicellulaire. Cette stratégique nous a conduit à identifier, dans les monocytes et cellules dendritiques, une signature moléculaire permettant la stratification des patients avec et sans myocardites. Nous montrons une exacerbation de la voie du TNF-α due à une diminution des inhibiteurs de NF-kB, et montrons que les patients avec myocardites ont une réponse faible à l'IFN de type I malgré la présence d'IFN-α/β dans le sang. Cette thèse explore comment les données de transcriptomes en cellules uniques peuvent être utilisées pour dévoiler des mécanismes moléculaires et des populations cellulaires impliqués dans les maladies pédiatriques inflammatoires.

Type I Interferons (IFNs) act as potent initiators of the immune response. Lack of response to IFNs can result in severe viral infections. By contrast, uncontrolled production of type I IFNs leads to chronic inflammation. The cGAS-STING pathway is an important DNA sensing pathway which can trigger a robust immune response by initiating the production of type I IFNs. Gain-of-function mutations in STING1, which codes for the Stimulator of Interferon Gene (STING), induce a constitutive activation of STING and result in a severe autoinflammatory disease termed STING-associated vasculopathy with onset in infancy (SAVI). SAVI is a rare genetic disease which typically includes pulmonary and cutaneous inflammation. Although high IFN production is thought to be the main cause of the symptoms observed in patients, STING can activate other pathways that are cell type specific, and their role in the onset and severity of SAVI remain to be elucidated. To address this question, we have gathered a cohort of 5 SAVI patients and 7 controls and have explored the transcriptome of their peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) at the single cell level. This dataset combines samples of patients before and after treatment, which has allowed us to evaluate the effect of the treatment both at cellular and molecular levels. To better understand which molecular characteristics of SAVI are a direct consequence of type I IFNs constitutive production, we generated a dataset of PBMCs treated with IFN-β and profiled them at the single cell level. Comparing the SAVI dataset and the IFN-β-stimulated PBMCs revealed drastic decrease of effector T cells and loss of MAIT cells in SAVI patients. We show that T cells of SAVI patients are in a constant activated state, associated with senescence and apoptosis. We highlight a group of pathologic monocytes in SAVI patients, which are highly inflammatory and express a strong integrated stress response (ISR) signature. Prediction of cell-cell communication suggest that pathogenic monocytes may drive the T cell hyperactivation. These results provide a deeper understanding on the molecular pathways underlying SAVI and could help improve patients' treatment. Additionally, we leverage the use of scRNA-seq data to pinpoint a SAVI patient with low ISR who has a second germline mutation in EIF2AK3, which was recently shown to be activated by STING to trigger the ISR. A second axis of my thesis concerned Multisystem Inflammatory Syndrome in Children (MIS-C). Severe COVID-19 patients present with a pulmonary inflammation and vascular defects reminiscent of what is observed in SAVI. This observation led us to get implicated in research against COVID-19 pandemic. SARS-CoV-2 infection was initially thought to induce only mild disease in children; however, it was soon revealed that it can provoke MIS-C, a severe pediatric post-acute inflammation, a few weeks after initial infection. This rare disease is characterized by multiorgan inflammation. Severe forms are further aggravated by myocarditis, but the mechanisms governing these severe forms are yet to be explored at the cellular level. We gathered a cohort of MIS-C patients with and without myocarditis to explore the mechanisms underlying the pathogenesis of the most severe forms. We used a multi-omics approach and combined proteomics, bulk, and single-cell transcriptomics to analyze the blood immune cells of 56 patients and age-matched controls. This strategy led to the identification of a molecular signature of monocytes and dendritic cells which allows the stratification of patients with severe myocarditis. We highlight an exacerbation of TNF-α signaling due to dampening of NF-kB inhibitors and show that patients with myocarditis have low response to type I IFNs despite presence of IFN-α/β in the blood. Overall, this thesis explores how to leverage single-cell transcriptomics to uncover molecular mechanisms and cell populations involved in inflammatory pediatric diseases.