Plateformes biomimétiques pour déchiffrer les rôles moléculaires et cellulaires du sulfate d'héparane sur la bioactivité de BMP2

Engineered Biomimetic platforms to analyse molecular and cellular role of Heparan Sulfate on BMP2 bioactivity

• Auteur / Autrice : Julius Sefkow-Werner
• Direction : Catherine Picart
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biotechnologie, instrumentation, signal et imagerie pour la biologie, la médecine et l'environnement
• Date : Soutenance le 15/12/2021
• Etablissement(s) : Université Grenoble Alpes
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale ingénierie pour la santé, la cognition, l'environnement (Grenoble ; 1995-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Laboratoire des matériaux et du génie physique (Grenoble)
• Jury : Président / Présidente : Antoine Delon
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Catherine Picart, Julien Gautrot, Karine Anselme, Emmanuel Belamie
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Sylvie Ricard-Blum, Stéphanie Descroix

Mots clés

Mots clés contrôlés

Automatisation

Intégrines

Surfaces (technologie) -- Analyse

Bionique

Héparane sulfate

Mots clés libres

Bmp2

Automatisation

Caractérisation de surface

Biomimitisme

Intégrines

Sulfate d'héparane

Heparan sulfate

Bmp2

Integrins

Automation

Surface characterization

Biomimetism

Résumé

La matrice extracellulaire (MEC) fournit une structure mécanique aux cellules et régule l'homéostasie et la différenciation. La molécule structurelle fibronectine contient des motifs d'adhésion tels que la séquence RGD avec une haute spécificité pour les β1- et β3 -intégrines mais aussi des domaines de liaison pour le glycosaminoglycane (GAG) héparan sulfate (HS). De plus, Le HS se lie à la protéine morphogénétique osseuse 2 (BMP2), connue pour son potentiel ostéoinductif est qui est ainsi appliquée cliniquement pour guérir de grands défauts osseux. Dans le corps humain, les HS sont liés à des protéines centrales formant des protéoglycanes HS qui font partie de la MEC ou apparaissent à la surface des cellules. Le rôle des HS extracellulaires et de surface des cellules, ainsi que des intégrines, dans la signalisation de la BMP2 et l'adhésion cellulaire font actuellement l'objet d'un débat scientifique. Quelques études suggèrent que les HS exogènes régulent à la hausse la signalisation de la BMP2, tandis que les HS de surface des cellules influencent négativement la bioactivité de la BMP2. De plus, la BMP2 induit une adhésion cellulaire médiée par l'intégrine et le HS de surface cellulaire médiatise l'adhésion cellulaire à la fibronectine. Cependant, l’influence des intégrines sur la signalisation de la BMP2 est méconnue. Il en va de même pour les interactions entre les intégrines et HS immobilisé et la BMP2 adsorbée dans le cadre de la différenciation ostéogénique. En outre, la relation entre les HS exogènes et ceux de la surface cellulaire est rarement abordée. Nous répondons à ces questions en concevant des surfaces modèles biomimétiques 2D basées sur une monocouche de streptavidine. Dessus, le ligand d'adhésion cRGD est co-fonctionnalisé avec des HS orientés sur lesquels la BMP2 s'adsorbe. La fonctionnalisation est précisément caractérisée ex situ à l'aide de techniques sensibles aux surfaces. Nous appliquons de plus la spectroscopie de corrélation d'image basée sur la fluorescence pour caractériser in situ les surfaces biomimétiques en termes de densité moléculaire. Nous développons cette technique en la combinant avec le photoblanchiment pour révéler des informations sur le nombre moyen et la distribution des fluorophores par molécule afin d'augmenter la précision. Pour améliorer la reproductibilité et le potentiel de contenu élevé de notre approche biomimétique, nous avons créé un protocole automatisé pour fabriquer des plateformes biomimétiques homogènes à l'aide d'un robot de manipulation de liquides. De multiples conditions peuvent être construites en parallèle dans des plaques à 96 puits et permettent d'étudier l'effet des membres de la famille des BMP à différentes concentrations adsorbées sur l'HS immobilisée. Nous constatons que les intégrines β1- et β3 sont fondamentales pour la signalisation BMP2-SMAD et l'expression de l'ALP dans les cellules C2C12, marqueurs de l'activité précoce de la BMP2 et de la différenciation ostéogénique, respectivement. La BMP2 liée à un HS exogène améliore la différenciation ostéogénique par rapport à la BMP2 directement immobilisée et le HS soutient l'activité de la BMP2. De plus, la BMP2 adsorbée sur le HS est plus bioactive que la BMP4, la BMP6 et la BMP7 en ce qui concerne la signalisation précoce de la BMP2. En plaçant des cellules CHO de type sauvage et celles présentant une déficience en HS à la surface cellulaire (csHS), nous révélons un effet positif du csHS sur la signalisation BMP2 à de faibles doses de BMP2 adsorbées. Enfin, nous montrons que le csHS a un effet négatif sur la propagation des cellules sur les surfaces de cRGD et encore plus sur les surfaces présentant du cRGD et du HS exogène. Nous concluons que les plates-formes biomimétiques fabriquées automatiquement, caractérisées avec précision et hautement flexibles sont un excellent outil pour étudier l'influence combinatoire des facteurs de croissance, des GAGs et des peptides sur le destin cellulaire.

The extra cellular matrix (ECM) provides mechanical structure to embedded cells and gives biochemical cues to regulate homeostasis and differentiation. The structural molecule fibronectin contains adhesion motifs such as the RGD sequence with high specificity for β1- and β3 -integrins but also binding domains for the glycosaminoglycan (GAG) heparan sulfate (HS). GAGs have a high swelling capacity due to their negative charge but also interact with growth factors to protect them from degradation and thus serve as a reservoir. HS binds bone morphogenetic protein 2 (BMP2), which is known for its osteoinductive potential and is clinically applied to heal large bone defects in combination with 3D scaffolds. In the human body, HS are bound to core proteins forming HS proteoglycans who are either part of the ECM or appear at the cell surface. The role of extra cellular and cell surface HS together with integrins on BMP2 signaling and cellular adhesion is currently under scientific debate. Few studies suggest that exogenous HS up-regulates BMP2 signaling whereas cell surface HS negatively influences BMP2 bioactivity. Further, BMP2 induces integrin-mediated cellular adhesion and cell surface HS mediates cell adhesion to fibronectin. However, it is not known how integrins influence BMP2 signaling or how they interact together with immobilized HS and adsorbed BMP2 with respect to osteogenic differentiation. Further, the relation between exogenous and cell surface HS is rarely addressed. We respond to these questions by engineering 2D biomimetic model surfaces based on a streptavidin monolayer, which allows co-immobilizing biotinylated molecules of interest and presenting them to cells. The adhesion ligand cRGD is co-functionalized with oriented HS to which BMP2 adsorbs and the areal mass densities and binding kinetics are precisely characterized ex situ using surface sensitive techniques such as spectroscopic ellipsometry (SE) and quartz crystal microbalance. For the first time, we apply fluorescence based image correlation spectroscopy to characterize biomimetic surfaces in situ for molecular density and measure values comparable to ex situ SE. We further develop this technique by combining it with photo bleaching to reveal information about the average number and distribution of fluorophores per molecule to increase the accuracy. To improve the reproducibility and the high content potential of our biomimetic approach, we created an automated protocol to fabricate homogenous biomimetic platforms with a liquid handling robot. Upon user demand, multiple independent conditions of the biomimetic platform can be build-up in parallel inside 96-well plates and allow studying the effect of members of the BMP family in different concentrations adsorbed to immobilized HS. First, we find that β1- and β3-integrins are both fundamental for the BMP2-SMAD signaling and ALP expression in C2C12 cells, markers for early BMP2 activity and osteogenic differentiation, respectively. Also, BMP2 bound to exogenous HS enhances osteogenic differentiation compared to BMP2 directly immobilized on the platform and HS sustains BMP2 activity. We have further evidence that BMP2 adsorbed on HS is more bioactive than BMP4, BMP6 and BMP7 regarding early BMP2 signaling. By plating CHO wild type cells and those with a cell surface HS (csHS) deficiency, we reveal a positive effect of csHS on BMP2 signaling at low adsorbed BMP2 doses, which is in contradiction to results with higher doses in literature. Finally, we show that csHS has a negative effect on cell spreading on cRGD surfaces and even more on surfaces presenting cRGD and exogenous HS. We conclude that automatically fabricated, precisely characterized and highly flexible biomimetic streptavidin platforms are a great tool to study the combinatorial influence of growth factors, GAGs and peptides on cell fate.