Etude des états conformationnels d'un transporteur ABC bactérien de drogues multiples, BmrA

Study of the conformational states of a bacterial multidrug ABC transporter BmrA

• Auteur / Autrice : Waqas Javed
• Direction : Christine Ebel, Jean-Michel Jault
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biologie structurale et nanobiologie
• Date : Soutenance le 17/12/2020
• Etablissement(s) : Université Grenoble Alpes
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale chimie et science du vivant (Grenoble ; 199.-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Institut de biologie structurale (Grenoble)
• Jury : Président / Présidente : Cécile Morlot
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Christine Ebel, Jean-Michel Jault, Martial Rey
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Francesca Gubellini, Guillaume Lenoir

Mots clés

Mots clés libres

Transporteurs ABC

Résistance à de multiples drogues

BmrA

Changements de conformation

Echanges hydrogène/deuterium couplées à la spectrométrie de masse

Diffusion des neutrons à petit angle

ABC transporters

Multidrug resistance

BmrA

Hydrogen/Deuterium Exchange coupled to Mass Spectrometry

Small Angle Neutron Scattering (SANS)

Conformational changes

Résumé

La résistance aux antibiotiques est une réalité à laquelle nous devons faire face. La résistance bactérienne aux antibiotiques peut être conférée par plusieurs mécanismes, dont la surexpression de pompes à efflux, certaines appartenant à la superfamille des transporteurs ABC (“ATP-binding cassette”). Les transporteurs ABC sont des protéines omniprésentes qui utilisent l'hydrolyse de l'ATP pour pomper une large gamme de substrats. Ils sont également responsables du développement des phénotypes de résistance à de multiple drogues dans les cellules cancéreuses et les microorganismes pathogènes.L'exportateur bactérien ABC BmrA (“Bacillus multidrug resistance ATP”), est homologue à ABCB1, un transporteur humain impliqué dans les phénotypes de résistance dans les cellules cancéreuses. Avec une connaissance approfondie de sa surexpression et de sa purification, BmrA est un archétype utile pour obtenir des informations sur le fonctionnement des transporteurs ABC de multiples drogues. Notre objectif est de déchiffrer les changements conformationnels associés au transport des médicaments.Nous avons montré que BmrA existe dans au moins deux conformations différentes, dans des micelles de détergent ou reconstitué dans des nanodisques. En l'absence de ligand (forme apo), différentes partie de BmrA fixe rapidement du deutérium comme le montre l'échange hydrogène deutérium couplé à la spectrométrie de masse (HDX-MS). La forme piégée par l'ADP induite par le vanadate montre une grande protection globale contre l'incorporation de deutérium. De plus, il a été observé que BmrA dans les nanodisques présente un profil de deutération différent en présence de médicament, indicatif d'une nouvelle conformation intermédiaire. De plus, en utilisant deux mutants affectés dans différentes étapes du cycle catalytique, il a été montré comment BmrA change de conformations au cours du cycle d'export des médicaments. Les résultats obtenus à partir de la diffusion de neutrons aux petits angles (SANS), brossent un tableau similaire et renforcent les résultats obtenus sur le cycle catalytique de BmrA.Ces résultats conduisent à une meilleure compréhension des changements de conformation de BmrA qui s’opèrent pour permettre le phénotype de résistance aux médicaments.

Antibiotic resistance is not the story of the future but a reality today. Bacterial resistance to antibiotics can be conferred by several mechanisms, including the overexpression of dedicated efflux pumps, some of them belonging to the ABC (“ATP-binding cassette”) transporters superfamily. ABC transporters are ubiquitous proteins that use ATP hydrolysis to pump a wide range of substrates. They are also responsible for the development of MDR (“MultiDrug Resistance”) phenotypes in cancer cells and pathogenic microorganisms.The bacterial ABC exporter BmrA (“Bacillus multidrug resistance ATP”), is structurally and functionally close to ABCB1, a human transporter involved in MDR phenotypes in cancer cells. Together with extensive knowledge in its overexpression and purification, BmrA is a useful archetypical transporter to gain information on the functioning of multidrug ABC transporters. Our goal is to decipher the conformational changes associated with drug transport.We showed that BmrA exists in at least two different conformations, in detergent micelles or when reconstituted in nanodiscs. In the absence of ligand (apo form), BmrA gets quickly exchanged with deuterium as shown by Hydrogen Deuterium Exchange Coupled to Mass Spectrometry (HDX-MS). The vanadate-induced ADP trapped form shows a large overall protection against deuterium incorporation. Moreover, it was observed that BmrA in nanodiscs shows a different deuteration profile in the presence of drug, indicative of a new intermediate conformation. In addition, using two different catalytic mutants of BmrA, that are trapped in two opposite conformations of the catalytic cycle, it was shown how BmrA changes conformations during the drug export cycle. The results obtained from Small Angle Neutron Scattering (SANS), on WT BmrA and the mutants, paint a similar picture and strengthen the results obtained on the catalytic cycle of BmrA.These results could potentially lead to a better understanding of the structural basis of MDR.