Laboratoire sur puce pour la détection d'événements cellulaires rares

Lab-on-chip for the detection of rare cell events

• Auteur / Autrice : Marion Valette
• Direction : Anne-Marie Gué, Karine Reybier
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Micro et Nanosystèmes
• Date : Soutenance le 16/12/2019
• Etablissement(s) : Toulouse 3
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Génie électrique, électronique, télécommunications et santé : du système au nanosystème (Toulouse)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Laboratoire d'Analyse et d'Architecture des Systèmes (Toulouse ; 1968-....)

Mots clés

Mots clés contrôlés

Immunologie

Microfluidique

Adipocytes

Mots clés libres

Cellules souches adipeuses

ASCs

Microfluidique

Films secs

Tri cellulaire

Filtration hydrodynamique

Exclusion immunologique

Adipose stem cells

ASCs

Microfluidics

Dry films

Cell sorting

Hydrodynamic filtration

Immunological exclusion

Résumé

Le tissu adipeux est une source riche en cellules souches multipotentes : les Cellules Souches Adipeuses (ASCs pour Adipose Stem Cells). Ces cellules, qui possèdent la capacité de se différencier en différents types cellulaires, ouvrent de nombreuses perspectives dans le domaine de la médecine régénératrice et dans des applications telles que le diagnostic du diabète de type 2. Connues pour migrer et circuler dans la lymphe, l'hypothèse de leur présence dans le sang n'est pas exclue mais aucune méthode n'existe afin de le prouver. L'objectif de ces travaux de thèse est alors de développer un laboratoire sur puce capable d'isoler les ASCs à partir d'échantillons biologiques complexes en mettant en application des méthodes microfluidiques de tri passives et sans marquage. Ce sont ainsi les propriétés intrinsèques des cellules qui sont exploitées. Or, les ASCs ne présentent aucune caractéristique physique spécifique. En effet, nous avons tout d'abord montré que leur diamètre est compris entre 10 et 25 µm, ce qui ne leur permet pas de se distinguer de la plupart des cellules sanguines. De même, ces cellules ne possèdent pas d'antigène spécifique sur leur membrane. Nous proposons alors un dispositif combinant deux étapes complémentaires afin d'isoler complètement les ASCs des autres types cellulaires. La première étape a pour objectif de prétraiter l'échantillon en retirant, par filtration hydrodynamique, toutes les cellules de diamètre inférieur à 10 µm. Ce dispositif doit ainsi permettre de retirer du milieu les globules rouges qui représentent plus de 99 % des cellules constituant le sang ainsi que les plaquettes et quelques globules blancs. Ces travaux de thèse ont démontré que le dispositif développé est capable de prétraiter efficacement un échantillon sanguin pur (humain ou murin) en éliminant plus de 99,9 % des globules rouges. De plus, il a été démontré que la filtration n'engendre pas de lyse cellulaire, ce qui est encourageant pour des questions de viabilité cellulaire et l'exploitation des cellules après filtration. L'échantillon alors obtenu contient les cellules d'intérêt ainsi que quelques cellules hématopoïétiques restantes. La deuxième étape a pour but de parfaire l'isolement des ASCs en les séparant des cellules hématopoïétiques restantes. Pour ce faire, la méthode employée, l'exclusion immunologique par cell rolling, se base sur la spécificité de la réaction antigène-anticorps. Les ASCs ne possédant pas d'antigène spécifique, ce sont les antigènes spécifiques des leucocytes qui ont été ciblés. L'objectif est ainsi de dépléter l'échantillon des leucocytes restants. Ces travaux ont mené à l'élaboration d'un protocole de fonctionnalisation de surface optimal. De plus, de premiers résultats encourageants sur le cell rolling sur une surface fonctionnalisée avec des anticorps anti-CD45 ont été obtenus.

Adipose tissue is a rich source of multipotent stem cells: Adipose Stem Cells (or ASCs). Due to their differentiation capabilities, ASCs became cells of considerable interest for regenerative medicine and are of high interest for type II diabetes diagnosis. Known to migrate and circulate in lymph, the hypothesis of their presence in blood is not excluded but no method exists to prove it. The aim of this study is to develop a lab-on-chip able to isolate ASCs from complex biological samples by using passive and label-free microfluidic sorting methods. These methods involve intrinsic properties of fluids and objects. Yet, ASCs do not have specific physical characteristic. We have demonstrated that their diameter is comprised between 10 and 25 µm: they cannot be distinguished from most of other blood cells. In addition, they do not present specific antigen on their membrane. In order to completely isolate ASCs from other cell types, we propose an original approach combining two complementary steps. The first step aims at pre-treating the sample by removing, via hydrodynamic filtration, all the cells with a diameter below 10 µm. With this device, red blood cells, which represent more than 99% of blood cells, platelets and some leukocytes, have to be removed. This study has demonstrated that the device is able to effectively pre-treat pure blood sample (either from human or from mouse) as it removes more than 99.9% of red blood cells. It has also been demonstrated that filtration does not lead to cell lysis, which is a promising result for cell viability and the reuse of cells after filtration. The obtained sample contains cells of interest and some remaining hematopoietic cells. The second step aims at refining ASCs isolation by separating them from remaining hematopoietic cells. The method used, called immunological exclusion by cell rolling, is based on antigen-antibody specific reaction. As ASCs do not have specific antigen, leukocytes antigens have been involved. The objective is so to deplete the sample of the remaining leukocytes. This study led to the elaboration of an optimised surface functionalization protocol. Moreover, promising results on cell rolling realised on a surface functionalized with anti-CD45 antibodies were obtained.