Étude de l'implication de la matrice extracellulaire dans la malignité des phéochromocytomes et des paragangliomes SDHB-dépendants

Study of extracellular matrix involvement in malignancy of SDHB-related pheochromocytomas and paragangliomas

• Auteur / Autrice : Mélanie Menara
• Direction : Judith Favier
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biologie cellulaire et moléculaire
• Date : Soutenance le 22/11/2016
• Etablissement(s) : Sorbonne Paris Cité
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Bio Sorbonne Paris Cité (Paris ; 2014-....)
• Partenaire(s) de recherche : établissement de préparation : Université Paris Descartes (1970-2019)
• Jury : Président / Présidente : Xavier Jeunemaître
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Judith Favier, Xavier Jeunemaître, Florence Ruggiero, Florence Cabon, Catherine Monnot, Laurence Amar
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Florence Ruggiero, Florence Cabon

Mots clés

Mots clés contrôlés

Mutation (biologie)

Tumeurs neuroendocrines

Mots clés libres

Biologie cellulaire et moleculaire

Cellular and molecular biology

Résumé

Les phéochromocytomes et les paragangliomes (PPGL) sont des tumeurs neuroendocrines rares qui se développent aux dépens des paraganglions et qui sont identiquement déterminées dans 40% des cas. Parmi les gènes de prédisposition, les mutations du gène SDHB qui code pour l’une des sous-unités catalytiques de la succinate déshydrogénase mitochondriale constituent un facteur de risque de phénotype métastatique associé à un mauvais pronostic. Mon travail de thèse avait pour objectif d’élucider le lien entre les mutations du gène SDHB et la malignité des PPGL par l’étude du rôle du microenvironnement tumoral et en particulier de la matrice extracellulaire (MEC) dans le processus métastatique. L’analyse transcriptomique de l’expression de 310 gènes associés a la MEC dans 188 PPGL humains de la cohorte COMETE, a mis en évidence une régulation spécifique de ces gènes dans les tumeurs présentant des mutations SDHx. J’ai utilisé un modèle murin de cellules chromaffines déficientes en succinate déshydrogénase, les cellules Sdhb-/-, en comparaison avec les cellules sauvages (wild-type, WT). Les cellules Sdhb-/‐ possèdent des capacités migratoires et adhésives accrues dues a l’accumulation de succinate inhibant les dioxygénases dépendantes du 2‐oxoglutarate (2‐OG). J’ai mis en évidence que la MEC secrétée par les cellules Sdhb‐/- est capable d’augmenter les capacités migratoires et d’adhésion des cellules WT. Inversement, la MEC secrétée par les cellules WT diminue la migration et l’adhésion des cellules Sdhb-/-. Ainsi, les cellules Sdhb‐/- semblent secréter une matrice qui favorise le replacement des cellules et donc leur potentiel métastatique. Afin d’identifier les acteurs responsables de ce phénotype particulier nous avons analyse le sécrétome de la MEC : le matrisome des cellules Sdhb-/- et des WT, nous permettant d’identifier la fibronectine, cible de l’hypoxie, comme l’une des protéines majeures de la MEC secrétée par les cellules Sdhb-/‐. J’ai montré que la fibronectine augmente de façon drastique la migration et l’adhésion des cellules WT et qu’elle participe a la migration des cellules Sdhb‐/-. L’analyse du transcriptome et du matrisome des cellules Sdhb-/- a également mis en évidence la surexpression de nombreux collagènes et en particulier le gène Col4a2 qui code pour l’un des composants majoritaires des membranes basales. J’ai montré que malgré l’accumulation de succinate dans les cellules Sdhb-/-, les collagènes hydroxylases 2-OG dépendantes, restent probablement actives ce qui permet la maturation des collagènes puis leur sécrétion dans le milieu extracellulaire. Cependant, le collagène IVα2 est fragmenté dans les cellules Sdhb-/- suggérant des modifications après sa sécrétion. J’ai ainsi montré que l’activation de la MMP9 dans les cellules Sdhb‐/-, participe à la dégradation du collagène IVα2. L’ensemble de ces résultats a ainsi révélé l’existence d’un remodelage de la MEC spécifique aux cellules Sdhb‐/- qui favorise le phénotype métastatique en promouvant notamment la migration et l’adhésion cellulaire. En parallèle de ce travail et dans le cadre d’un projet collaboratif, j’ai montré que seules les cellules Sdhb-/- sont capables d’induire le processus d’angiogenèse compare aux cellules WT et de le maintenir en faisant croître des vaisseaux pré-existants en 3-dimensions. Au sein de la même collaboration, j’ai également travaillé sur la mise au point d’une lignée humaine de cellules chromaffines tumorales en 3-dimensions à partir de culture primaire de PPGL humains. Ce travail se poursuit actuellement et pourrait donner lieu à la mise au point des premières conditions expérimentales permettant de cultiver ces cellules in vitro.

Pheochromocytomas and paragangliomas (PPGL) are rare neuroendocrine tumors, which arise from paraganglia and are genetically determined in 40% of cases. Among the predisposition genes, mutations in the SDHB gene, which encodes the catalytic core subunit of the mitochondrial enzyme, succinate dehydrogenase, are associated with malignancy and poor prognosis. The main objective of my thesis project was to elucidate the link between SDHB mutations and PPGL malignancy by studying the role of tumor microenvironment and in particular of the extracellular matrix (ECM) in the metastatic process. The transcriptomic analysis of 310 ECM‐associated genes in 188 human PPGL of the COMETE collection showed a specific regulation of ECM-encoding genes in SDHx-mutated tumors. I used a mouse model of Sdhb deficient chromaffin cells compared to their wild-type (WT) counterparts. Sdhb-/- cells display increased migratory and adhesive capacities cause by succinate accumulation that inhibit 2-oxoglutarate (2--‐OG) dependent dioxygenases. I showed that the ECM secreted by Sdhb‐/- cells is able to increase migration and cell adhesion of WT cells. Conversely, the ECM secreted by WT cells decreases migration and adhesion of Sdhb-/- cells. Hence, Sdhb-/- cells seem to secrete an ECM promoting cell motility and thus their metastatic potential. To identify specific ECM components responsible for this particular phenotype, we analyzed the ECM secretome, i.e. the matrisome, of both cells types. This study identified fibronectin as one of main ECM protein secreted by Sdhb-/- cells. I showed that fibronectin drastically increases migration and adhesion of WT cells and participates to Sdhb- /- cells migration. Sdhb-/- transcriptome and matrisome analyses also highlighted the overexpression of many collagens and in particular Col4a2 encoding one of main component of basement membranes. I demonstrated that despite succinate accumulation in Sdhb‐/- cells, 2-OG dependent collagen hydroxylases remain apparently active, allowing collagen maturation and their subsequent secretion in the extracellular space. Besides, collagen IVα2 is fragmented in Sdhb-/‐ cells suggesting post-excretion modifications. I showed that MMP9 activation in Sdhb‐/‐ cells, participates to collagen IVα2 degradation. Alltogether, these results revealed the existence of Sdhb‐/- specific remodelling of the ECM which may promote mestastatic phenotype by inducing migration cell and adhesion. In parallel, and as a part of a collaborative project, I showed that Sdhb‐/- chromaffin cells (but not WT cells) are able to induce the angiogenic process and to maintain the growth of pre-existing vessels in 3-dimensions. Within the same collaboration, I also worked on the development of a human tumoral chromaffin cells line using 3-dimensions spheroid cultures of human PPGL. This work is ongoing and could lead to the development of the first experimental conditions for growing human PPGL cells in vitro.