Développement des sondes fluorescentes pour la détection de l’ADN quadruplex

Development of fluorescent probes for the detection of quadruplex DNA

• Auteur / Autrice : Xiao Xie
• Direction : Marie-Paule Teulade-Fichou
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Chimie organique
• Date : Soutenance le 28/01/2015
• Etablissement(s) : Paris 11
• Ecole(s) doctorale(s) : Ecole doctorale Chimie de Paris-Sud (Orsay, Essonne ; 2006-2015)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Institut Curie (Paris ; 1978-....) - Chimie et modélisation pour la biologie du cancer (Orsay, Essonne ; 2015-....)
• Jury : Président / Présidente : Rachel Méallet-Renault
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Marie-Paule Teulade-Fichou, Rachel Méallet-Renault, Jean-Louis Mergny, Martine Demeunynck, Sylvain Ladame, Anton Granzhan
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Jean-Louis Mergny, Martine Demeunynck

Mots clés

Mots clés contrôlés

Interactions ADN-ligand

Sondes fluorescentes

Sondes à acide nucléique

Mots clés libres

ADN quadruplex

Détection fluorescence

Colorant styryle

Colorant PDC coumarine

Quadruplex DNA

Fluorescence detection

Styryl dye

PDC-coumarine dye

Résumé

Les acides nucléiques simple-Brins contenant des répétitions de guanines peuvent former des structures secondaires non canoniques dites G-Quadruplexes, composées de plusieurs couches de quartets de guanine. Malgré de nombreuses études in vivo, les preuves de présence de structures quadruplexes in vivo restent indirectes. L’objectif de ce travail était la recherche de sondes fluorescentes capables de signaler la présence d'ADN quadruplex et détecter sa structure (topologie).Deux séries de sondes fluorescentes ont été envisagées et préparées : les colorants styryles (majoritairement distyryles) et les dérivés PDC-Coumarines. La conception de ces deux séries est basée sur l’échafaudage bisquinolinium pyrido¬dicarboxamide (PDC-360A), un ligand sélectif ayant une bonne affinité vis-À-Vis des structures d’ADN quadruplexes, mais qui est non-Fluorescent. En s’inspirant de cette molécule et du motif styryle, connu pour ses propriétés spectroscopiques, nous avons préparé une librairie de colorants distyryles. Une deuxième série, les dérivés PDC-Coumarine, est synthétisée afin d’introduire la propriété fluorescente de la coumarine dans le PDC par une liaison covalente.Les propriétés de colorant de ces deux librairies (65 composés) ont été étudiées en présence de nombreuses structures d’ADN (quadruplex et duplex) en utilisant un criblage par fluorescence sur microplaques et des méthodes de titration. Nos résultats montrent que certains colorants synthétisés possèdent une haute réponse fluorimétrique (facteur d’augmentation de fluorescence de 200 à 600) vis-À-Vis de différentes structures d’ADN et d’ARN quadruplex, ayant une très faible réponse fluorimétrique vis-À-Vis de l’ADN duplex. Cela permet de marquer sélectivement l’ADN quadruplex dans la solution ou sur les gels d’électrophorèse. Ces résultats représentent une première étape vers l’utilisation de ces sondes dans un contexte biologique, par exemple dans l’imagerie de fluorescence.

Single-Stranded nucleic acids containing guanine repeats can form non-Canonical secondary structures called G-Quadruplexes. These structures are composed of several guanine quartets, maintained by hydrogen bonds and metal cations (K+ or Na+) coordinated between G-Quartets. In spite of being well-Studied in vitro, the evidence for the presence of quadruplex DNA structures in vivo remains mainly indirect. The objective of this work was research of fluorescent probes that can signal the presence of quadruplex DNA and detect its structure (topology).Two series of fluorescent probes were considered and prepared: styryls dyes (mostly distyryls) and PDC-Coumarin derivatives. The design of these two series is based on the molecular scaffold of bisquinolinium pyridodicarboxamide (PDC-360A), a selective ligand with good affinity for quadruplex DNA structures but which is not fluorescent. Inspired by this molecule and the styryl motif, which is known for its spectroscopic properties, we considered a library of distyryles dyes. A second series, the PDC-Coumarin derivatives, was developed to introduce the fluorescence property of coumarin in the PDC by a covalent link. The properties of dyes of these two libraries (65 compounds) were studied in the presence of a number of DNA structures (quadruplex and duplex) by a fluorescent screening using microplate and titration methods. Our results show that some of synthesized dyes display high fluorescence response (i.e. fluorescence increase factor from 200 to 600) for different quadruplex DNA and RNA structures, while having a very low fluorimetric response for duplex DNA. This allows a selective visualization of quadruplex DNA in solution or in electrophoresis gel. These results represent the first steps towards the use of these probes in a biological context, for example in fluorescence imaging