Étude structurale de l'hélicase réplicative et de l'activation du primosome de Helicobacter pylori

Structural study of the replicative helicase and primosome activation from helicobacter pylori

• Auteur / Autrice : Alexandre Bazin
• Direction : Laurent Terradot
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biochimie
• Date : Soutenance le 29/01/2015
• Etablissement(s) : Lyon 1
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Interdisciplinaire Sciences-Santé (Villeurbanne ; 1995-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Molecular Microbiology and Structural Biochemistry (Lyon ; 1999-....)
• Jury : Président / Présidente : Gilbert Deléage
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Joanna Timmins
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Hannu Myllykallio, Sébastien Fribourg, Wim Burmeister

Mots clés

Mots clés contrôlés

Radiocristallographie

Helicobacter pylori

Hélicases

ADN -- Réplication

Mots clés libres

Réplication de l’ADN

Hélicase

Helicobacter pylori

Cristallographie aux rayons X

DNA replication

Helicase

Helicobacter pylori

X-ray crystallography

Résumé

Durant la réplication du chromosome bactérien, le désappariement du double brin d'ADN est réalisé par l'hélicase hexamérique DnaB. Chez Escherichia coli, le positionnement de l'hexamère de DnaB sur l'ADN simple brin dans le sens 5'-3'est permis par le facteur de chargement. La primase DnaG interagit ensuite avec l'hélicase pour former le primosome. Chez Helicobacter pylori, aucun facteur de chargement n'a été identifié, ce qui est également le cas pour la majorité des espèces bactériennes. De plus, DnaB d'H. pylori (HpDnaB) peut complémenter des souches mutantes d'E.coli DnaBts et DnaCts suggérant que HpDnaB peut jouer le rôle des deux protéines. Pour mieux comprendre le mode d'action de HpDnaB, nous avons résolu sa structure cristallographique à une résolution de 6.7 Å. Celle-ci révèle que la protéine s'assemble en dodécamère, formé par deux hexamères interagissant par leurs domaines N-terminaux (NTD). Nos expériences en diffusion des rayons X aux petits angles (SAXS) montrent que le dodécamère de HpDnaB adopte une conformation modifiée et dynamique en solution. Nous avons ensuite étudié la structure de HpDnaB après interaction avec HpDnaGHBD et/ou l'ADN simple brin par chromatographie d'exclusion stérique couplée à la diffusion de la lumière multi-angles (SEC-MALS) et par SAXS. Ces expériences suggèrent qu'après interaction avec HpDnaGHBD, le double hexamère est dissocié en simples hexamères formant un complexe avec HpDnaGHBD. De plus, HpDnaB forme des hexamères avec l'ADN simple brin en présence d'AMP-PNP. L'ensemble de nos résultats suggère que la formation du primosome d'H. pylori conduit à la dissociation du dodécamère en deux complexes HpDnaB6•HpDnaG3

During bacterial chromosomal replication, unwinding of double stranded DNA is performed by the hexameric helicase DnaB. In Escherichia coli, the positioning of DnaB hexamers onto replication forks in the 5’to 3’ direction is dedicated by helicase loader. DnaB then interacts with the DnaG primase helicase binding domain (DnaGHBD) to form the primosome. Helicobacter pylori does not encode for a DnaC homologue, which is also the case of most bacterial species. Moreover, H. pylori DnaB (HpDnaB) could complement two temperature–sensitive mutants of E. coli dnaBts and dnaCts, suggesting that the HpDnaB was able to bypass DnaC in these cells. To gain insights into HpDnaB mode of activation, we have solved the crystal structure of HpDnaB at 6.7Å resolution. The structure reveals a novel dodecameric organisation where HpDnaB assembles as planar stack-twisted double hexamers via N-terminal domain (NTD)-rings interactions. Small angle X-ray scattering analysis (SAXS) demonstrates that HpDnaB adopts a modified and dynamic structure in solution but maintains dodecameric architecture. We have then investigated the structure of HpDnaB upon interaction with HpDnaGHBD and/or ssDNA using size exclusion chromatography coupled to multiangle light scattering and SAXS. These experiments show that upon interaction with HpDnaGHBD, HpDnaB double hexamer dissociates into single hexamers to form a complex with HpDnaGHBD. Moreover, we found that HpDnaB also forms hexamers in complex with ssDNA in the presence of AMP-PNP. Collectively, these data suggest that primosome assembly in H. pylori results in the dissociation of the double hexamer into two HpDnaB6•HpDnaG3 sister primosomes