Evaluation de peptides régulateurs positifs de la masse musculaire

Evaluation of the anti-myostatin activity of Small Leucine Rich Proteoglycans’ peptides

• Auteur / Autrice : Nelly El Shafey
• Direction : Antoine Kichler, Daniel Scherman
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biothérapies et Biotechnologies
• Date : Soutenance le 05/11/2014
• Etablissement(s) : Paris 5
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Biologie et biotechnologie (Paris ; 1997-2014)
• Jury : Président / Présidente : Jean-Christophe Pagès
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Antoine Kichler, Daniel Scherman, Jean-Christophe Pagès, David Israeli, Luc A. Cynober
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Jean-Christophe Pagès, David Israeli

Mots clés

Mots clés contrôlés

Facteur de croissance transformant bêta-1

Maladies musculaires

Myogénèse

Mots clés libres

Muscles squelettiques

Myostatine

Décorine

Small Leucine Rich Proteoglycans

Skeletal muscles

Myostatin

Decorin

Small Leucine Rich Proteoglycans

Résumé

La myostatine est un membre de la superfamille du TGF-β (transforming growth factor-β) impliqué dans la régulation négative de la masse musculaire. En effet, l’absence de myostatine (MSTN) chez la souris est responsable d’un phénotype hypermusclé. Depuis, il a été confirmé qu’une baisse de l’activité de la MSTN conduit à une augmentation de la masse musculaire chez d’autres espèces, y compris l’Homme. L’identification de la MSTN et des conséquences de son invalidation sur le développement musculaire ouvre de nombreuses perspectives en médecine humaine. Il existe de nombreuses situations pathologiques qui conduisent à une fonte musculaire importante : c’est le cas pour des maladies génétiques telles que les dystrophies musculaires ou pour d’autres pathologies comme le cancer et le sida. Différentes approches anti-MSTN ont été développées au cours des dernières années, par exemple un anticorps anti-MSTN ou des ligands de la MSTN. L’objectif majeur de ce projet de recherche a consisté à identifier de nouveaux inhibiteurs de la MSTN, en particulier appartenant à la famille de protéines appelées SLRP (Small Leucine Rich Proteoglycans). Il a été mis en évidence que des membres de cette famille, notamment la décorine (DCN) ainsi que des fragments issus de la DCN dont le peptide 31-71, sont capables de se lier à la MSTN en présence de zinc. La DCN peut alors empêcher l’activité de la MSTN en s’opposant à la liaison de cette dernière à son récepteur. Dans ce contexte, nous avons étudié des séquences peptidiques plus restreintes de la DCN murine pouvant interagir efficacement avec la MSTN et des peptides dérivés d’autres SLRP pour leur aptitude à lier la MSTN. Afin de faciliter le criblage in vitro de ces composés, nous avons tout d’abord créé une lignée cellulaire HEK293T exprimant stablement une cassette inductible par la MSTN fusionnée au gène de la luciférase (pCAGA-Luc). Parmi les candidats testés, le peptide mDCN48-71 a été le plus intéressant de par sa forte activité anti MSTN in vitro comparée aux autres, avec un IC50 de 7 µM. Notons également que le peptide mDCN48-71 n’a pas inhibé d’autres membres de la superfamille du TGF-β : TGF-β2, activine A et GDF-11 – ce qui suggère une spécificité d’action du peptide. En outre, des études d’anisotropie de fluorescence ont permis de prouver l’interaction directe du peptide mDCN48 71 avec la MSTN et la dépendance au zinc de cette liaison. Pour finir, nous avons montré que des injections intramusculaires répétées de ce peptide chez le modèle murin dystrophique mdx, conduisent à une augmentation significative de la masse des muscles tibiaux antérieurs injectés de l’ordre de 21 % par rapport aux muscles contrôles.

Myostatin is a member of the transforming growth factor-β (TGF-β) superfamily and a negative regulator of skeletal muscle growth. In 1997, lack of myostatin (MSTN) was related to increased muscle mass in mice. Since then, MSTN has been found in other species including humans. Inhibition of this protein offers opportunities in human medicine for many pathological conditions leading to a significant muscle loss: genetic disorders such as muscular dystrophy as well as other diseases like cancer and AIDS. Recently, several anti-MSTN approaches have been developed such as antibodies against MSTN or naturally occurring proteins that bind to and inactivate MSTN. The aim of this research was to identify novel inhibitors of MSTN, especially belonging to the SLRP (Small Leucine Rich Proteoglycans) family of proteins. Members of this family, including decorin (DCN) and fragments thereof (murine derived peptide mDCN31-71) can bind to MSTN in a zinc-dependent manner. In this context, smaller peptide sequences of mouse DCN and peptides from other SLRP have been studied for their ability to bind MSTN. First, we created a HEK293T stable cell line expressing the luciferase gene under control of a MSTN-inducible promoter (pCAGA-Luc) so as to screen these compounds in vitro. Here we report that the peptide mDCN48-71 shows the stronger activity anti MSTN in vitro among all the peptides tested (IC50 = 7 µM). Furthermore, other members of the TGF β superfamily: TGF β2, activin A and GDF-11 are not inhibited by the mDCN48-71 peptide - which suggests a specificity of its action. By performing fluorescence anisotropy studies, we proved the direct and zinc dependent interaction between peptide mDCN48-71 and MSTN. Finally, we showed that repeated intramuscular injections of this peptide in the dystrophic mdx mouse model led to a significant increase of the injected tibialis anterior muscle mass (21 %) compared to control muscles.