Analyse du rôle du H2O2 et du stress oxydant intracellulaire dans les réponses aux agents pathogènes par l'usage d'un mutant conditionnel déficient en catalase et par profilage métabolique

Analysis of the role of H2O2 and intracellular oxidative stress in pathogen responses using a conditional catalase-deficient mutant and metabolite profiling approaches

• Auteur / Autrice : Sejir Chaouch
• Direction : Graham Noctor
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Sciences biologiques. Biologie végétale
• Date : Soutenance en 2010
• Etablissement(s) : Paris 11
• Partenaire(s) de recherche : autre partenaire : Université de Paris-Sud. Faculté des sciences d'Orsay (Essonne)

Mots clés

Mots clés contrôlés

Glutathion

Peroxyde d'hydrogène

Mots clés libres

Acide salicylique

NADPH oxidase

Résumé

Les formes actives de l'oxygène (FAO) constituent un élément clé pour la réponse des plantes aux stimuli de l'environnement parmi lesquels l'attaque par des agents pathogènes pour laquelle le rôle des FAO est bien étudié. Cependant, l'origine subcellulaire de production des FAO ainsi que l'impact des FAO produites dans différents compartiments subcellulaires au cours de la réponse aux agents pathogènes restent à élucider. Il en est de même concernant l'existence d'éventuelles interactions entre FAO d'origines subcellulaires différentes. Les peroxisomes constituent une source majeure de H2O2 produit au cours du processus de photorespiration et qui, chez Arabidopsis, est principalement métabolisé par la CATALASE2 (CAT2). En accord avec ceci, le mutant cat2 montre un phénotype conditionnel faisant apparaître des lésions spontanées sur ses feuilles lorsque cultivé en jours longs (JL) mais pas en jours courts (JC). L'un des buts de la présente étude était donc d'identifier des facteurs expliquant cette dépendance à la photopériode. Premièrement, il a été montré que la formation des lésions chez cat2 est associée avec une accumulation de glutathion oxydé et accompagnée par une activation de réponses de défense manifestées par une résistance accrue à une bactérie virulente. Malgré le stress oxydant induit par l'importante production de H2O2, les réponses de défense induites chez cat2, y compris la mort cellulaire, se sont révélées totalement dépendantes de l'acide salicylique (AS) synthétisé via la voie de l'isochorismate. Les réponses de défense absentes chez cat2 en JC ont été induites par la complémentation par l'AS. Deuxièmement, le profilage métabolique non ciblé m'a permis d'identifier des composés contrôlés par l'AS et/ou le H2O2. Particulièrement, les teneurs en myo-inositol (MI) étaient diminuées chez cat2 indépendamment de l'AS. La complémentation de cat2 cultivé en JL par du MI a supprimé la mort cellulaire et les réponses de défenses associées. L'inversion de ces réponses, par le blocage de la synthèse de l'AS ou par l'ajout de MI, n'a pas coincidée avec une diminution du stress oxydant mesuré par des transcrits marqueurs ou par la perturbation du glutathion. Troisièmement, le blocage, par une approche génétique, de l'accumulation du GSSG chez le double mutant cat2 cad2 indique un rôle joué par le glutathion dans les réponses dépendantes de l'AS. Ceci a été souligné par l'étude du mutant gr1 affecté pour une glutathion réductase. Finalement, afin d'étudier l'existence d'interactions entre les FAO intracellulaires et la fonction des NADPH oxydases, les double mutants cat2 atrbohD et cat2 atrbohF ont été produits. Il s'est révélé que les deux NADPH oxydases interagissaient avec les FAO intracellulaires pour spécifiquement contrôler des réponses dépendantes de l'AS, incluant la mort cellulaire. Ainsi, en se basant sur nos données et les connaissances acquises sur les interactions biotiques, nous avons émis une hypothèse décrivant un potentiel dialogue entre les FAO intra et extraclullaires survenant au cours des interactions plantes-pathogènes impliquant l'AS.

Reactive oxygen species (ROS) are key players in environmental signalling, and their roles in pathogen responses are weil described. However, the subcellular origin of ROS production during pathogen responses, as weil as the impact of ROS produced at different sites, remain to be established. The peroxisomes are a major source of intracellular HzOz generated in processes such as photorespiration, and previous studies have shown that, in Arabidopsis, this HzOz is metabolized primarily by CAT ALASE2 (CAT2). Accordingly, cat2 knockouts show a conditional phenotype in which lesions appear on the leaves of the mutant grown in long days (LD) but not short days (SD). The present study investigated the factors underlying this daylength-dependent response. First, it is shown that lesion formation in cat2 is associated with accumulation of oxidized glutathione (GSSG), and accompanied by activation of defence responses and enhanced resistance to virulent bacteria. Despite the oxidative stress triggered by increased intracellular H20Z production in cat2, defence responses, including cell death, are totally dependent on salicylic acid (SA) synthesis through the isochorismate pathway. The failure of cat2 to activate defence responses in SD can be complemented by exogenous SA. Second, non-targeted metabolite profiling identified cbmpounds under the control of SA and/or HzOz. Ln particular, myo-inositol (MI) was identified as a compound decreased in cat2 in an SA-independent manner. Complementation of cat2 growing in LD with MI abrogated cell death and associated defence responses. Reversion of these responses by blocking SA synthesis or by supplying MI was not associated with decreased oxidative stress measured as marker transcript accumulation or glutathione perturbation. Third, genetically blocking accumulation of GSSG in cat2 cad2 double mutants pointed to a role for glutathionein SA-dependent responses, and this was underscored by analysis of gr] knockouts for glutathione reductase. Finally, to investigate possible interactions between intracellular ROS production and NADPH oxidase function, double cat2 atrboh mutants were produced and biotic stress responses and metabolite profiles compared to the parent single mutants. Both NADPH oxidases were shown to interact with intracellular ROS to specifically control SA-dependent responses, including cell death. Based on these and literature data, a hypothesis is constructed to describe possible crosstalk between extracellular and intracellular ROS during SA-dependent plant-pathogen interactions.