Vers l’étude structurale des récepteurs couplés aux protéines G

Towards structural studies on G protein-coupled receptors

• Auteur / Autrice : Cédric Pierre Fiez-Vandal
• Direction : Franc Pattus, Sōichi Iwata
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biochimie des protéines
• Date : Soutenance en 2008
• Etablissement(s) : Université Louis Pasteur (Strasbourg) (1971-2008) en cotutelle avec Imperial College, London

Mots clés

Mots clés contrôlés

Médicaments -- Récepteurs

Expression génique

Protéines G

Récepteurs cellulaires

Résumé

Les Récepteurs Couplés aux Protéines G (RCPG) contrôlent l'activité physiologique de la majorité des cellules. Ils constituent la cible privilégiée de la plupart des drogues et de plus de 50 % des médicaments connus. Nous décrivons dans cette thèse les progrès réalisés dans l’expression et la purification d’un certain nombre de ces récepteurs membranaires. Nos RCPG, issues de la collection MePNet, ont été exprimés dans le système Pichia pastoris avec un epitope FLAG et un tag 10xHis en N-ter, et une extrémité C-ter biotinylée. De nombreux essais de purification, combinant plusieurs types de résines, n’ont malheureusement permis de ne récupérer qu’une très faible fraction des récepteurs exprimés. Dans un deuxième temps, l’utilisation en « batch » de billes couplées à la streptavidine nous a cependant mené vers des essais de cristallogenèse. Nous avons enfin cherché à stabiliser certains de ces récepteurs en les fusionnant en C-ter avec une sous-unité Gα ou bien en N-ter avec OmpA.

G protein-coupled receptors (GPCRs) mediate the majority of cellular responses to hormones and neurotransmitters. Consequently, they constitute the largest family of pharmaceutical targets. Here, we report progress made in expressing and purifying mammalian GPCRs from the MePNet collection in the methylotrophic Pichia pastoris yeast expression system. Beginning initially with flask cultures and subsequently with medium cell density fermentor cultures, GPCRs, expressed with N-ter FLAG epitope and decahistidine, and C-ter biotinylation fusion tags, were subjected to various purification methods. The use of home made streptavidine-coated beads in batch gave the most success in purifying these GPCRs. After having checked their oligomerization state, three dimensional crystallization trials were conducted by using the sitting-drop technique. Other approaches included generating fusion proteins to enhance expression and stability, and to increase the amount of hydrophilic surface area.