Etude du système ubiquitine-protéasome : analyse du rôle de la protéine hHR23/Rad23 dans l'ubiquitylation de p53 et recherche de cofacteurs du protéasome 26S

Analysis of the ubiquitin-proteasome system: role of the protein hHR23 in p53 ubiquitylation and search for 26S proteasome cofactors

• Auteur / Autrice : Aurélie Le Feuvre
• Direction : Olivier Coux
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biochimie et biologie moléculaire
• Date : Soutenance en 2008
• Etablissement(s) : Montpellier 2

Mots clés

Mots clés contrôlés

Ubiquitine

Protéasome

Mots clés libres

Protéasome

Ubiquitylation

Cofacteurs p53

Résumé

Le système Ubiquitine-Protéasome (UbPr) est au cœur de la plupart des processus biologiques, du fait de son rôle central dans la protéolyse régulée. La dégradation d'une protéine via le système UbPr implique généralement deux grandes étapes successives: l'ubiquitylation de la protéine et sa dégradation par le protéasome 26S. Cependant, il reste de nombreuses questions quant au fonctionnement du système UbPr. Durant ma thèse, j'ai suivi deux axes de recherches visant à étudier l'étape mal caractérisée qu'est l'interface ubiquitylation/dégradation. Le premier était l'étude du rôle de la protéine Rad23/hHR23, décrite comme un adaptateur impliqué dans l'adressage des substrats ubiquitylés au protéasome, sur la régulation de l'ubiquitylation de la protéine p53 par Hdm2. J'ai montré que l'effet de Rad23 est double: en plus d'inhiber la multi-mono- et la poly-ubiquitylation de p53 par Hdm2, Rad23 favorise l'auto-ubiquitylation de Hdm2. Par ailleurs, j'ai confirmé que le domaine de Rad23 responsable de ces effets est le domaine UBA2, et j'ai montré que la dimérisation de Rad23 semble impliquée dans ces processus. Le deuxième axe était d'identifier de nouveaux facteurs cellulaires impliqués dans l'adressage des substrats ubiquitylés au protéasome ou qui assistent ce dernier dans la protéolyse. Mon but était de purifier par fractionnement cellulaire des cofacteurs du protéasome qui ont un effet activateur sur la dégradation de la protéine p53 ubiquitylée. J'ai obtenu, dans un premier temps, des résultats très intéressants indiquant que le complexe PA28 αβ pourrait jouer un rôle dans l'activation du protéasome 26S. Cependant, ces résultats n'ont pas pu être compris faute de temps et en raison de problèmes expérimentaux. Dans un second temps, j'ai purifié à partir des extraits cellulaires une autre activité qui était capable de s'associer et d'activer le protéasome 26S. J'ai ainsi identifié deux activateurs potentiels: la protéine Ecm29 et le complexe de traduction eIF3

The ubiquitin-proteasome system (UPS) plays a key role in most biological pathways, due to its central function in regulated proteolysis. Protein degradation through the UPS usually occurs in two main steps: ubiquitylation of proteins and subsequent degradation by the 26S proteasome. However, many open questions remain concerning UPS functioning. During my thesis, I followed two main research axes aimed at investigating the ill-understood ubiquitylation/degradation interface. One axis was to further study the role(s) in Hdm2-mediated p53 ubiquitylation of the Rad23/hHR23 protein, known to be an adaptator involved in addressing ubiquitylated substrates to the proteasome. I showed that Rad23 effect is twofold: in addition to inhibit both multi-mono- and poly-ubiquitylation of p53 by Hdm2, Rad23 somehow favors Hdm2 auto-ubiquitylation. Moreover, I confirmed that the domain responsible for the effects of Rad23 is its UBA2 domain, and showed that Rad23 dimerization might be involved in these processes. The second axis was aimed at identifying new cellular factors involved in targeting ubiquitylated substrates to the proteasome, or in assisting 26S proteasome during protein degradation. My goal was to purify and characterize proteins, through cell extract fractionation, having a positive effect on degradation of ubiquitylated p53 by purified 26S proteasome. Rapidly, my work was focused on the PA28 αβ complex, that was found in active fractions, and I obtained striking results indicating that it could play a role in 26S activation. However, due to time constraints and technical difficulties, this part of my work could not be brought to a conclusive end yet. In a second part of this project, I purified from cell extracts another activity that is able to both bind to and activate the 26S proteasome. Two potential candidates were identified in the active fractions: the Ecm29 protein and the translational complex eIF3