Production et caracterisation d'anticorps diriges contre le recepteur de la substance p par l'approche des peptides complementaires

Production and characterization of antibodies directed against the substance p receptor using the complementary peptide methodology

• Auteur / Autrice : OLIVIER DERY
• Direction : Jean-Yves Couraud
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Sciences biologiques et fondamentales appliquées. Psychologie
• Date : Soutenance en 1996
• Etablissement(s) : Paris 11

Résumé

Dans le but d'obtenir des anticorps capables de reconnaitre le site de liaison de neuropeptide substance p sur le recepteur nk-1, nous avons applique la methodologie des peptides complementaires. Des lapins et des souris ont ete immunises avec deux peptides complementaires de la substance p, appeles ps3 et ps5, dont les sequences ont ete deduites de la lecture, dans les deux sens, du brin d'adn oppose a celui codant la substance p. Des anticorps polyclonaux anti-ps3 et anti-ps5 ainsi que des anticorps monoclonaux anti-ps5 ont ete obtenus. Notre etude a porte plus particulierement sur la caracterisation des proprietes immunologiques, biochimiques et cytologiques d'un anticorps monoclonal anti-ps5, le mab12. L'injection de l'anticorps mab 12 chez une souris a induit la production d'anticorps reconnaissant specifiquement la substance p, ce qui suggere que cet anticorps monoclonal porte une image structurale du neuropeptide. Ceci a ete confirme par des experiences biochimiques de liaison, realisees essentiellement sur des membranes de glande parotide de rat ou des cellules cho transfectees avec l'adnc du recepteur nk-1. Sur ces preparations, la substance p et l'anticorps entrent en competition pour reconnaitre un meme site de liaison membranaire. Enfin, en immunocytochimie, l'anticorps mab 12 a permis de localiser le recepteur nk-1 dans la moelle epiniere de rat, en microscopie optique et electronique. La capacite de se fixer sur le site de liaison de la substance p du recepteur nk-1 rend l'anticorps mab 12 susceptible d'exercer une activite pharmacologique, de type agoniste ou antagoniste. La caracterisation de la structure moleculaire de son site de liaison (paratope) devrait donc permettre de concevoir des peptides biologiquement actifs. Dans le cadre de la methodologie des peptides complementaires, basee a l'origine sur l'observation d'interactions entre deux peptides presentant des profils d'hydropathie opposes (une hormone et son peptide complementaire synthetique par exemple), nous nous sommes demandes si ces inversions de profils d'hydropathie pouvaient avoir une signification biologique particuliere, c'est-a-dire etre impliquees dans les mecanismes de reconnaissance entre deux molecules naturellement presentes dans l'organisme. Les interactions antigene-anticorps constituant un modele de choix pour tester cette hypothese, nous nous sommes interesses a la reconnaissance de la substance p par un anticorps monoclonal anti-substance p. Le clonage et le sequencage de l'adn complementaire des chaines lourdes et legeres de cet anticorps a demontre l'existence, dans les regions hypervariables, de sequences peptidiques dont le profil d'hydropathie est oppose a celui de l'epitope de la substance p reconnu par l'anticorps. En outre, les parametres cinetiques de l'interaction de cet anticorps avec une serie de peptides, presentant ou non des profils d'hydropathie similaires a celui de la substance p, ont ete determines par la technique des biosenseurs. Les resultats ont etabli qu'une opposition des profils d'hydropathie entre epitope et paratope est un facteur important dans l'etablissement de la liaison antigene-anticorps et nous ont conduit a proposer une hypothese generale selon laquelle ces inversions de profils d'hydropathie pourraient intervenir au cours des premieres etapes de la formation de complexes entre bio-molecules