Fidelité des ADN polymérases de la famille D

Fidelity of family D DNA polymerases

• Auteur / Autrice : Leonardo Betancurt Anzola
• Direction : Ludovic Sauguet, Kelly Zatopek
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biochimie et biologie structurale
• Date : Soutenance le 13/11/2024
• Etablissement(s) : Sorbonne université
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Complexité du vivant (Paris ; 2009-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Biologie Moléculaire Structurale et Processus Infectieux (Paris ; 2012-....)
• Jury : Président / Présidente : Catherine Vénien-Bryan
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Ghislaine Henneke
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Julian Sale, Sylvie Doublié

Mots clés

Mots clés contrôlés

Dynamique moléculaire

ADN -- Réplication

Cryomicroscopie

Archéobactéries

ADN polymérases

Mots clés libres

ADN polymérase

Biotechnologie

Ingénierie

DNA polymerase

Biotechnology

Engineering

Résumé

La fidélité de la réplication de l'ADN est un processus fondamental qui se produit dans chaque organisme et qui est essentiel pour la stabilité du génome. Ce processus est assuré par des ADN polymérases réplicatives qui appartiennent à quatre familles différentes : A, B, C et D. J'ai étudié la fidélité de la réplication de l'ADN de la principale ADN polymérase réplicative chez les archées, PolD, une ADN polymérase de la famille D avec un site actif unique qui ressemble à celui des ARN polymérases. Pourtant, PolD est une ADN polymérase dépendante de l'ADN. J'ai utilisé plusieurs approches pour comprendre la fidélité de cette enzyme. Premièrement, j'ai utilisé la cryo-EM pour obtenir la première structure de PolD en mode exonucléase, et nous avons utilisé cette structure pour concevoir des mutants de PolD et comprendre la base moléculaire de l'activité exonucléase de cette polymérase unique. Ensuite, j'ai utilisé le séquençage de nouvelle génération pour mesurer la fidélité non seulement de PolD, mais aussi des membres des autres familles d'ADN polymérases réplicatives. Nous avons découvert que la mutation d'un résidu volumineux qui empêche l'incorporation de ribonucléotides (et donc la synthèse de l'ARN) augmente la fidélité de PolD in vitro.J'ai également mené des expériences supplémentaires pour comprendre les spécificités moléculaires de PolD, notamment une nouvelle structure intermédiaire de PolD avec l'ADN dans le site actif de la polymérase, avant que l'activité exonucléase ne soit déclenchée. De plus, j'ai étudié l'effet des bases endommagées sur le brin matrice sur PolD et PolB (l'ADN polymérase réplicative accessoire chez les archées). J'ai observé des spécificités différentes pour les deux polymérases en fonction du type de lésion rencontrée. Enfin, je présente un test à débit moyen pour déterminer les points de contrôle moléculaires pour la détection de l'incorporation de ribonucléotides dans PolD. Avec ce travail, nous avons élargi notre compréhension de la réplication de l'ADN et des mécanismes moléculaires qui régissent la synthèse de l'ADN à haute fidélité chez les archées.

DNA replication fidelity is a fundamental process that occurs in every organism. This process is carried out by replicative DNA polymerases that exist in four different families: A, B, C, and D. I studied DNA replication fidelity of the main replicative DNA polymerase in Archaea, PolD, a family D DNA polymerase with a unique active site that resembles RNA polymerases. Yet PolD is a DNA dependent DNA polymerase. I used multiple approaches to understand the fidelity of the enzyme. First, I used Cryo-EM to obtain the first structure of PolD in an exonuclease mode, we use this structure to design mutants of PolD and understand the molecular basis of the exonuclease activity of this unique polymerase. Next, I used next generation sequencing to obtain a measure of the fidelity of not only PolD but members if the other families of replicative DNA polymerases. Excitingly, we found that mutating a bulky residue that prevents ribonucleotide incorporation (and therefore the synthesis of RNA) increases the fidelity of PolD in vitro. I also carried out additional experiments to understand the molecular specificities of PolD, importantly a novel intermediate structure of PolD with DNA within the polymerase active site, before the exonuclease activity is triggered. Additionally, I studied the effect of damaged bases on the template strand on PolD and PolB (the accessory replicative DNA polymerase in Archaea), I observed different specificities for the two polymerases and the type of lesion they encounter. Finally, I show a medium throughput assay to determine the molecular checkpoints for ribonucleotide incorporation detection within PolD.With this work we expanded our understanding on DNA replication and the molecular mechanisms that govern high fidelity DNA synthesis in archaea.