Dispositif Complet de Préparation d'Echantillons pour l'Analyse Multi-Omique

Comprehensive Sample Preparation Device for Multi-Omics Analysis

• Auteur / Autrice : Ranjith Kumar Ravi Kumar
• Direction : Yann Verdier
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Chimie Analytique
• Date : Soutenance le 08/03/2023
• Etablissement(s) : Université Paris sciences et lettres
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Chimie physique et chimie analytique de Paris Centre
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Laboratoire Plasticité du cerveau (Paris ; 2014-....) - Laboratoire Plasticité du Cerveau Brain Plasticity (UMR 8249)
• Partenaire(s) de recherche : établissement opérateur d'inscription : Ecole supérieure de physique et de chimie industrielles de la Ville de Paris (1882-....)
• Jury : Président / Présidente : Andrew Griffiths
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Yann Verdier, Martial Marbouty, Virginie Redeker, Pascal Cosette, Joelle Vinh
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Martial Marbouty, Virginie Redeker

Mots clés

Mots clés libres

Spectrometrie de masse

Microfluidique

Metaproteomique

Mass spectrometry

Microfluidics

Metaproteomics

Résumé

Les trois dernières décennies ont vu l'apparition du concept de microbiome, qui désigne l'activité d'une communauté microbienne occupant un habitat bien défini (environnement ou animal hôte). L'étude des microbiomes vise à comprendre la contribution et l'impact de l'activité de la communauté microbienne. Contrairement à la méthode traditionnelle d'étude des espèces individuelles, l'accent est mis ici sur la communauté entière et la contribution des espèces individuelles au sein de cette communauté. Les trois grandes questions auxquelles les technologies disponibles permettent actuellement de répondre sont les suivantes : (i) quelles espèces sont là ? (ii) que peuvent-elles faire ? (iii) que font-elles ?Deux technologies analytiques sont couramment : la spectrométrie de masse pour les protéines et le séquençage de nouvelle génération pour les acides nucléiques. Avant d'utiliser ces technologies, le traitement pré-analytique des échantillons est une étape cruciale. Il existe des protocoles distincts pour la métaprotéomique, la métagénomique ou la métatranscriptomique afin de traiter les échantillons microbiens. Mais il n'existe toujours pas de système intégré permettant de préparer les échantillons pour ces différentes analyses.L'étude actuelle a permis de développer un protocole utilisant un dispositif microfluidique appelé ChipFilter pour effectuer une préparation automatisée et intégrée des échantillons pour la métaprotéomique et l'isolement séquentiel des acides nucléiques. Le ChipFilter a été développé précédemment dans le laboratoire pour effectuer la préparation d'échantillons pour la protéomique. Dans le présent travail, j'ai d'abord amélioré cette technologie pour effectuer la lyse de cellules bactériennes et fongiques, la purification des protéines, la protéolyse et l'isolement des acides nucléiques. Cinq différents protocoles permettent une préparation efficace des échantillons pour la métaprotéomique seule ou la méta-protéomique. Les flux de travail 1 à 3 ont permis la préparation d'échantillons avec lyse cellulaire, purification des protéines, protéolyse et récupération des peptides pour LC-MS/MS. Le tampon de lyse modifié dans le protocole 5 a permis une lyse cellulaire accrue des bactéries Gram +ve. Le protocole 4 a permis de récupérer les acides nucléiques après la récupération des peptides.Tous les protocoles ont été validés avec des mélanges standards - (1) un mélange de nombre égal de cellules de E. coli, S. cerevisiae et B. subtilis ; (2) vingt et une espèces de nombre disproportionné de cellules représentants le microbiome intestinal. Enfin, la validation du protocole métaprotéomique utilisant ChipFilter a été effectuée en utilisant le microbiome intestinal de la souris isolée à partir des fèces. La comparaison du protocole de ChipFilter avec les protocoles standards a montré une meilleure couverture du proteome avec le ChipFilter. Les peptides générés contenaient plus de sites de clivages manqués, ce qui a conduit à des séquences peptidiques plus longues et à une meilleure couverture des protéines. Nous avons identifié des protéines pour au moins 20 espèces parmi les 21 considérées. Le traitement du lysat du microbiome intestinal de la souris a conduit à l'identification de 650 protéines en moyenne à partir de quatre réplicats biologiques. En ce qui concerne les acides nucléiques extraits, leur stabilité structurelle, le mécanisme de leur rétention dans le ChipFilter et la validation par PCR ont été effectués.En conclusion, un protocole complet de préparation d'échantillons utilisant le ChipFilter a été réalisé pour la méta-protéogénomique. Ce protocole de préparation d’échantillon est automatisable, il peut être facilement intégré avec les étapes de collecte d'échantillons, et il permet d'effectuer des études multi omiques simultanément sur le même échantillon en permettant d'identifier un nombre élevé de peptides, ce qui le rend très prometteur pour des études de microbiome à haut débit.

Last three decades has seen the growth of the buzz word “microbiome” which demonstrates the theatre of activity performed by a microbial community occupying a reasonably well-defined habitat (environmental or within a host animal). Studying microbiomes will help to understand the microbial community driven contribution/impact that is created by their activity. Unlike the traditional way of studying individual species, the focus here is diversified to the entire community and the contribution of individual species within this community. The three broad question that can currently be answered by available technologies are (i) who is there? (ii) what can they do? (iii) what are they doing?Two analytical technologies – mass spectrometry and next generation sequencing, has been vital for the microbiome studies and are routinely used for sequencing proteins and nucleic acids respectively. An important labour-intensive step before using these technologies is the pre-analytical sample processing. Separate workflows for metaproteomics, metagenomics or metatranscriptomics exist in order to process the microbial samples. But, an integrated system to perform sample preparation for both protein and nucleic acid sequencing is still unavailable.The current study will demonstrate novel workflows utilizing a microfluidic device named ChipFilter to perform automated and integrated sample preparation for metaproteomics and sequential nucleic acid isolation. The ChipFilter was previously developed in the laboratory to perform sample preparation for bottom-up proteomics. In the present work, I have first upgraded this technology to perform bacterial and fungal cell lysis, protein purification, proteolysis and nucleic acid isolation. Five different workflows demonstrated allow the possibility of effective sample preparation for only metaproteomics or collective meta proteogenomic. Workflows 1-3 allowed sample preparation with cell lysis, protein purification, proteolysis and peptide recovery for LC-MS/MS. While, modified lysis buffer in workflow 5 allowed increased cell lysis of Gram +ve bacteria. Workflow 4 allowed to recover nucleic acids after peptide recovery.All the required workflows to the mentioned processes have been demonstrated with standard mixtures – (1) three equal cell number consisting of E. coli, S. cerevisiae and B. subtilis; (2) twenty-one disproportionate cell number species that are representatives of the gut microbiome. Finally, validation of the metaproteomics workflow using ChipFilter was done using the mouse gut microbiome isolated from mice faeces. The comparison of ChipFilter workflow with existing workflow showed higher identification and generation of unique peptides by the ChipFilter workflow. The generated peptides contained higher missed cleavages leading to longer peptide sequences and better protein coverage. Identification of proteins from complex samples such as gut microbiome was also made possible by ChipFilter workflows with proteins identified for at least twenty species among the twenty-one considered. Processing of mice gut microbiome lysate led to an identification of 650 proteins in average from four biological replicates. In terms of nucleic acids extracted, their structural stability, mechanism behind their retention inside ChipFilter and validation by PCR was also done.In conclusion, a comprehensive sample preparation workflow utilizing the microfluidic ChipFilter was achieved for meta proteogenomics. The possibility of this workflow to automate sample preparation with potential to be easily integrated for sample collection, perform multi omics studies on same sample simultaneously and identify high peptide for microbiome studies can be very helpful to perform high-throughput microbiome studies with ease.