Cellules souches pluripotentes induites (CSPi) exprimant RET pour la modélisation de l'hématopoïèse et du cancer du poumon non-à petites cellules

RET-altered Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) for modeling Hematopoiesis and Non-Small Cell Lung Cancer (NSCLC)

• Auteur / Autrice : Paul Marcoux
• Direction : Ali Turhan, Annelise Bennaceur-Griscelli
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Immunologie
• Date : Soutenance le 01/12/2023
• Etablissement(s) : université Paris-Saclay
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Innovation thérapeutique : du fondamental à l'appliqué
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Modèles de cellules souches malignes et thérapeutiques (Villejuif, Val-de-Marne ; 2015-....)
• Partenaire(s) de recherche : référent : Université Paris-Saclay. Faculté de pharmacie (Orsay, Essonne ; 2020-....)
• Partenaire(s) de recherche : graduate school : Université Paris-Saclay. Graduate School Santé et médicament (2020-....)
• Jury : Président / Présidente : Eric Deutsch
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Stéphane Vincent, Evelyne Lauret, Jamila Faivre
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Stéphane Vincent, Evelyne Lauret

Mots clés

Mots clés contrôlés

Cellules cancéreuses

Gène RET

Hématopoïèse

Poumon -- Cancer

Cellules souches pluripotentes induites

Mots clés libres

CSPI

CPNPC

Hématopoïèse

RET

Modélisation

IPSC

NSCLC

Hematopoiesis

RET

Models

Résumé

Les cellules souches pluripotentes induites (CSPi) sont générées en reprogrammant des cellules adultes pour les ramener à un état semblable à l'état embryonnaire. Les CSPi ont la capacité de se différencier en divers types de cellules, ce qui en fait des outils précieux pour la médecine régénératrice, la modélisation des maladies et la découverte de médicaments.Lorsqu'un gène « driver » a été identifié dans le cas d'une maladie monogénique ou maligne, il est possible d'utiliser à la fois une CSPi dérivée d'un patient et de générer une CSPi isogénique contrôle pour identifier les caractéristiques spécifiques liées à la mutation. Nous avons utilisé cette stratégie pour étudier l'effet du gène REarranged during Transfection (RET), un récepteur de tyrosine kinase, au cours de la différenciation des CSPi dans deux contextes. Nous avons d'abord étudié le rôle potentiel de RET dans l'induction des cellules hématopoïétiques. Dans la deuxième partie, l'objectif était de reproduire un carcinome pulmonaire malin in vitro en générant des cellules progénitrices pulmonaires (CPP) et des organoïdes à partir de ces CSPi. Pour répondre à ces deux objectifs, nous avons utilisé des CSPi dérivées d'un patient porteur de la mutation somatique RETC634Y (iRETC634Y), causant l'autophosphorylation de la protéine RET et donc l'activation constitutive de sa voie de signalisation. Nous avons complété nos études avec la génération d'une CSPi RETC634Y knock-in (PB68-RETC634Y).Dans la première partie de ce manuscrit, nous avons étudié le rôle RET dans l'hématopoïèse dérivée des CSPi en utilisant des stratégies d'induction hématopoïétique in vitro permettant de générer de manière reproductible des cellules hématopoïétiques avec les marqueurs de CSH. Les CSPi témoins ont été comparées aux CSPi exprimant la version mutée de RET. Les analyses transcriptomiques ont révélé un profil d'expression spécifique dans les cellules hématopoïétiques dérivées de la CSPi iRETC634Y, comprenant la surexpression de gènes associés à la voie des MAPKs et de protéines régulant négativement l'hématopoïèse. Ces résultats suggèrent que l'activation de RET pourrait être associée à un effet inhibiteur sur l'hématopoïèse dérivée des CSPi, potentiellement par l'activation de la voie des MAPKs.Dans la deuxième partie de ce travail, nous nous sommes demandé si nous pouvions générer de manière reproductible des CPP à partir de CSPi dérivées de patients porteurs de la mutation somatique RETC634Y. Nous avons utilisé un protocole de 16 jours dans le but de générer un des progéniteurs pulmonaires pouvant reproduire un modèle de carcinome pulmonaire non à petites cellules (CPNPC) lié à l'activation de la protéine RET. En effet, les réarrangements oncogéniques de RET peuvent survenir dans 1 à 2% des adénocarcinomes pulmonaires et seuls quelques modèles d'études pour cette maladie sont disponibles. Nous avons généré des CPP exprimant les marqueurs caractéristiques des progéniteurs pulmonaires. Les CPP dérivées de CSPi porteur de la mutation RETC634Y ont montré une surexpression de marqueurs associés au cancer par rapport aux CSPi témoins. L'analyse transcriptomique a révélé des signatures distinctes indiquant une dédifférenciation pulmonaire dans les tumeurs CPNPC, ainsi qu'une signature suractivée associée à la mutation RETC634Y, potentiellement liée à des mauvais pronostics de CPNPC. Les résultats ont été validés ultérieurement en utilisant le modèle de CSPi où la mutation RETC634Y avait été knock-in, mettant en évidence les marqueurs de cancer PROM2 et C1QTNF6, connus pour leur association avec des pronostics défavorables. De plus, les CPP dérivées de CSPi porteur de la mutation RETC634Y ont montré une réponse positive à l'inhibiteur de RET, le Pralsetinib, comme en témoigne la régulation à la baisse des marqueurs de cancer. Cette étude établit le premier modèle de CPNPC lié à l'activation de l'oncogène RET généré à partir de CSPi dérivées de patients.

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) are generated by reprogramming adult cells back into an embryonic-like state. iPSCs can be differentiated into various cell types, making them a valuable tool for regenerative medicine, disease modeling and drug discovery.In case of monogenic or malignant diseases where a driver gene has been identified, it is possible to use both patient-derived iPSCs and their CRISPR-corrected isogenic control iPSCs to identify the distinct characteristics linked to the mutation. We have used this strategy to unravel the effect of REarranged during Transfection (RET), a tyrosine kinase receptor, during iPSC differentiation within two different contexts. We first studied the potential role of RET in the induction of hematopoietic cells. In the second part, the objective was to replicate a malignant lung carcinoma in vitro by generating lung organoids and lung progenitor cells (LPC) from these iPSCs. For these purposes we have used an iPSC derived from a patient carrying the RETC634Y somatic mutation (iRETC634Y) which is responsible for the autophosphorylation of the protein RET and therefore the constitutive activation of its signaling pathway. We have completed our studies with the generation of a RETC634Y knock-in iPSC (PB68-RETC634Y).In the first part of this manuscript, these iPSCs were differentiated into hematopoietic cells to investigate the role of RET in iPSC-derived hematopoiesis. Indeed, previous studies have shown that RET plays a role in mice hematopoiesis as demonstrated by RET knock-out mice exhibiting significant deficiencies in hematopoiesis. In the context of cord blood (CB) cells, RET activation led to a significant amplification of hematopoietic stem cell (HSCs). These published results prompted us to analyze the potential role of RET in iPSC-derived hematopoiesis. We have studied this potential by using in vitro hematopoietic induction strategies allowing reproducible generation of hematopoietic cells with HSC markers using control versus RET-activated or overexpressed iPSCs. As opposed to the reports in mice and adult CB cells, we report an inhibitory effect of RET activation in the context of iPSCs. Transcriptomic analyses revealed a specific activated expression profile in iRETC634Y, including overexpression of genes associated with the MAPK network and negative hematopoietic regulator activities. These findings suggest that RET activation might be associated with inhibitory effects on iPSC-derived hematopoiesis, potentially through MAPK activation.In the second part of this work, we have asked whether we could reproducibly generate LPCs from patient-derived iPSCs carrying the RETC634Y somatic mutation using a 16-day protocol with the purpose to generate a model of RET-driven non-small cell lung cancer (NSCLC). Indeed, RET oncogenic rearrangements can occur in 1-2% of lung adenocarcinomas and only a few models for studying this disease are available. We have shown the successful generation of LPCs expressing expected lung progenitor markers. LPCs generated from RETC634Y iPSCs displayed an overexpression of cancer-associated markers as compared to control iPSCs. Transcriptomic analysis revealed distinct signatures indicating lung multilineage dedifferentiation in NSCLC tumors, along with an upregulated signature associated with the RETC634Y mutation, potentially linked to worse NSCLC prognosis. The findings were further validated using the RETC634Y knock-in iPSC model, highlighting key cancerous targets PROM2 and C1QTNF6, known for their association with poor prognostic outcomes. Moreover, LPCs derived from RETC634Y iPSCs showed a positive response to the RET inhibitor Pralsetinib, evidenced by the downregulation of cancer markers. This study establishes the first model of RET-driven NSCLC LPCs generated from patient-derived iPSCs.